王国明，尹婉嫱，乔阳，李研科，李秋志，杜丽平*

（1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.承德避暑山庄企业集团有限责任公司，河北平泉067500）

浓香型“山庄老酒”中吡嗪类物质的分析研究

王国明1，尹婉嫱2，乔阳2，李研科1，李秋志1，杜丽平2*

（1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.承德避暑山庄企业集团有限责任公司，河北平泉067500）

应用液-液萃取（LLE）法结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）对浓香型山庄老酒中吡嗪类物质进行分析，共定性了8种吡嗪类物质，分别是2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪，并对其中6种吡嗪类物质进行了定量分析。结果表明，2,6-二甲基吡嗪含量最高，为504.64 μg/L，三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的含量在100 μg/L以上，2-甲基吡嗪及2,3-二甲基吡嗪的含量分别为33.14 μg/L、22.48 μg/L。

液-液萃取；气相色谱-质谱法；浓香型白酒；吡嗪类物质

吡嗪类物质是1、4位含两个杂氮原子的杂环类化合物，一般具有烤香、坚果香、爆米花香、咖啡香等香味特征。白酒中的吡嗪类物质含量甚微，大多在10-9～10-7，但是其对白酒风味起着重要的作用。特别是四甲基吡嗪，据报道是白酒中的健康成分，有抗氧化活性，具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板凝聚等作用，被广泛用于治疗心脑血管疾病[1-3]。因此，近年来对酒类中吡嗪类化合物的研究越来越多。样品前处理方法主要有液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）法[4-5]和顶空固相微萃取（head-space solidphase microextraction，HS-SPME）法[7-11]，样品分析方法主要有气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spec trometry，GC-MS）法[6，12]，气相色谱（gas chromatography，GC）法[10，13]，液相色谱（liquid chromatography，LC）法[14-15]和气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法[6]。

白酒中的吡嗪类物质含量较少，对其的成分测定易受其他挥发性物质干扰。余晓等[4]采用液液萃取法结合GC-MS，将酒样调酸，使用旋转蒸发仪除去大部分水、乙醇和易挥发性成分，乙醚萃取吡嗪类成分，在兼香型白酒中定性出29种吡嗪类成分。王柏文等[5]沿用液液萃取法，结合GC-MS与气相色谱分析-氮磷检测器（gas chromatography-nitrogen and phosphorus detector，GC-NPD），从国井芝麻香型白酒中准确定性了14种吡嗪类化合物。王莉等[6]采用液液萃取法，结合气相色谱-质谱-离子扫描联用技术（GC/MS-SIM），直接进样定量分析了7种白酒中4种吡嗪类物质。

液液萃取法可以很好的去除水、乙醇和干扰测定的易挥发性成分，对吡嗪类物质的测定更有针对性，是一种很好的方法。本实验的目的在于研究“山庄老酒”中的吡嗪类成分，为白酒的健康成分研究补充基础数据。本研究采用顶空固相微萃取法结合GC-MS对浓香型山庄老酒中吡嗪类物质进行了分析，用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）08标准谱库定性法，保留指数定性法和标准品定性法定性了8种吡嗪类物质，并用外标法对其中2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪这6种物质进行了定量分析。本研究补充了浓香型白酒中吡嗪类物质的数据资料，对研究白酒的健康性具有良好意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“山庄老酒”浓香型白酒（55°）：承德避暑山庄企业集团有限责任公司；2-甲基吡嗪标准品、2,5-二甲基吡嗪标准品、2,6-二甲基吡嗪标准品、2,3-二甲基吡嗪标准品、三甲基吡嗪标准品、四甲基吡嗪标准品：美国Alfa Aesar公司；乙醚（分析纯）、无水硫酸钠（分析纯）、无水乙醇（分析纯）：天津市化学试剂一厂。

1.2 仪器与设备

Agilent7890A/5975CGC-MS联用仪：美国安捷伦公司；EYELA N-1100旋转蒸发器：环球（香港）科技有限公司。1.3方法

1.3.1 标样的配制

将2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪用无水乙醇按一定比例进行稀释。配制为4个浓度梯度制定标准曲线，作为定量依据。

标样1：2-甲基吡嗪0.28mg/L、2,5-二甲基吡嗪0.71mg/L、2,6-二甲基吡嗪13.99 mg/L、2,3-二甲基吡嗪0.17 mg/L、三甲基吡嗪1.32 mg/L、四甲基吡嗪0.75 mg/L。

标样2：2-甲基吡嗪0.94mg/L、2,5-二甲基吡嗪2.37mg/L、2,6-二甲基吡嗪46.60 mg/L、2,3-二甲基吡嗪0.57 mg/L、三甲基吡嗪4.41 mg/L、四甲基吡嗪2.49 mg/L。

标样3：2-甲基吡嗪2.83mg/L、2,5-二甲基吡嗪7.11mg/L、2,6-二甲基吡嗪139.90 mg/L、2,3-二甲基吡嗪1.72 mg/L、三甲基吡嗪13.22 mg/L、四甲基吡嗪7.46 mg/L。

标样4：2-甲基吡嗪28.3mg/L、2,5-二甲基吡嗪71.1mg/L、2,6-二甲基吡嗪1 399 mg/L、2,3-二甲基吡嗪17.2 mg/L、三甲基吡嗪13.22 mg/L、四甲基吡嗪74.6 mg/L。

1.3.2 液液萃取方法

100 mL酒样加入10 mL 11 mol/L HCl溶液，将氢离子浓度调成1 mol/L，50℃水浴条件下用旋转蒸发器除去乙醇，用40 mL新重蒸的乙醚萃取3次，合并水相，用12 mol/L NaOH溶液将pH值调至7，再用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至10，用40 mL新重蒸的乙醚萃取3次，合并有机相，加入8 g无水硫酸钠，干燥过夜，过滤，氮吹浓缩至0.5 mL，待GC-MS分析浓缩后酒样中吡嗪类物质含量。

1.3.3 色谱条件

进样口温度250℃，不分流模式，进样量1 μL，色谱柱Agilent CP-Wax CB（50 m×250 μm×0.2 μm）石英毛细管柱，载气为高纯氦气（纯度＞99.999 9%），流速0.8 mL/min。升温程序：起始温度50℃，保持3 min，以1.5℃/min升至85℃，保持5 min，然后以5℃/min升至150℃，然后以10℃/min升至220℃，后运行温度240℃，保持15 min，流速2 mL/min。

1.3.4 质谱条件

离子源：电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度230℃；电子轰击能量70 eV；连接口温度280℃；质量扫描范围30～500 amu。

1.3.5 定性定量方法

定性：NIST08标准谱库定性；保留指数（retention index，RI）定性；标准品（standard，S）定性。

定量：用标准品制作标准曲线，用外标法定量。

1.3.6 计算公式

取0.1μL正构烷烃混标进样，运用线性升温公式算出每种香气化合物的保留指数（RI）值，保留指数计算公式如下：

式中：tx为分析组分出峰的保留时间，min；tn和tn+1是碳原子数为n和n+1正构烷烃出峰的保留时间，min。

2 结果与分析

2.1 “山庄老酒”中吡嗪类物质的GC-MS分析

吡嗪混合标准品总离子流色谱图见图1，各吡嗪标准品标准曲线见图2，“山庄老酒”中吡嗪类物质的GC-MS总离子流色谱图见图3。

通过NIST08标准谱库定性、保留指数定性和标准品定性这三种定性方法共同对浓香型“山庄老酒”中吡嗪类物质进行定性分析，共定性出8种吡嗪类物质，分别为2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪。用外标法对2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪和四甲基吡嗪进行定量，各组分鉴定结果见表1。

由表1可知，含量最高的是2,6-二甲基吡嗪，为504.64μg/L；100 μg/L以上的有三甲基吡嗪和四甲基吡嗪，2-甲基吡嗪及2,3-二甲基吡嗪的含量分别为33.14 μg/L、22.48 μg/L。2.2白酒中的吡嗪类化合物分析

余晓等[4]报道白酒中的吡嗪类化合物总量大致分为4个层次。酱香酒中吡嗪类物质含量较高，其中茅台酒呈特高量，总量在3200μg/L以上；郎酒等总量在2300～3700μg/L范围；五粮液、古井贡酒等某些浓香型白酒中吡嗪类化合物总量在1 000～2 000 μg/L之间；洋河酒等浓香型白酒及清香型白酒汾酒含量较低，仅为200～540 μg/L。本研究中已经定量出的6种吡嗪类物质总含量为937.11 μg/L，总含量接近于余晓等[4]报道的第三层次，接近于五粮液、古井贡酒等其他浓香型白酒的水平。张艳红等[10]测定了酱香型白酒茅台酒和郎酒中吡嗪类物质的含量，由测定结果也可看出，酱香型白酒中吡嗪类物质含量较高，高于浓香型白酒，其中茅台酒中2,6-二甲基吡嗪达790.5 μg/L，三甲基吡嗪和四甲基吡嗪分别达到951.1 μg/L和809.2 μg/L。乔慧等[15]测定了清香型酒和老白干香型酒中吡嗪类物质的含量，清香型汾酒和老白干香型酒中2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪含量均低于浓香型山庄老酒，但四甲基吡嗪的含量高于山庄老酒。据余晓等[4]报道，在浓香型白酒五粮液中2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪含量都较少，2,6-二甲基吡嗪含量最高，达到376 μg/L，三甲基吡嗪和四甲基吡嗪含量也较高，均达到100 μg/L以上，且三甲基吡嗪含量高于四甲基吡嗪，该结果与“山庄老酒”中这六种吡嗪类物质的含量规律相近。余晓等[4]的报道中还涉及到一种浓香型白酒——洋河大曲。洋河大曲中也含有山庄老酒中检测到的8种吡嗪类物质，不过含量均≤100 μg/L，其中2,6-二甲基吡嗪含量最高，为75 μg/L。WU J F等[9]检测了今世缘白酒中的吡嗪类物质，“山庄老酒”中检测的8种吡嗪类物质在今世缘浓香型白酒中均被检出，在今世缘浓香型白酒中，三甲基吡嗪含量最高，超过900 μg/L，其次是吡嗪，含量超过200 μg/L。

本研究中使用了液液萃取法对酒样进行前处理。根据吡嗪类物质一般呈碱性的特征，根据文献报道将酒样调至氢离子浓度为1 mol/L，使得吡嗪类物质转化成盐进入水相，用浓缩加溶剂萃取的方法去除水分、乙醇和部分挥发性物质，以防干扰测定。之后，将水相调至碱性，使已经成盐的吡嗪类物质重新析出，再用乙醚萃取出来。这种方法能有效去除干扰组分，使吡嗪类物质的分析更有针对性，能定性分析出更多的吡嗪类物质。王柏文等[5]优化了液液萃取的条件，研究发现，酒样调酸时将氢离子浓度调至1 mol/L能得到较为稳定和理想的实验结果。将水相溶液回调至碱性时，碱性条件对目标化合物的影响不大。王柏文等[5]在国井芝麻香型白酒中定性出14种吡嗪类化合物，山庄老酒中检测到的8种吡嗪类物质在国井芝麻香型白酒中均有检出，芝麻香型白酒中吡嗪类物质种类比浓香型白酒更为丰富。王莉等[6]使用液液萃取法处理酒样，定量了7种白酒中2-乙基-6-甲基吡嗪，三甲基吡嗪，2,3-二甲基-5-乙基吡嗪和四甲基吡嗪的含量。

3 结论

应用液液萃取法结合GC-MS对浓香型山庄老酒中吡嗪类物质进行分析，共定性了8种吡嗪类物质，分别是2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪，2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪。并对其中6种吡嗪类物质进行定量，结果表明，2,6-二甲基吡嗪含量最高，为504.64 μg/L；三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的含量在100 μg/L以上；2-甲基吡嗪及2,3-二甲基吡嗪的含量分别为33.14 μg/L、22.48 μg/L。本研究为“山庄老酒”中健康成分的研究提供了依据，补充了浓香型白酒中吡嗪类物质的数据资料，具有较好的参考价值。

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WANG Guoming1,YIN Wanqiang2,QIAO Yang2,LI Yanke1,LI Qiuzhi1,DU Liping2*
(1.College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China; 2.Chengde Mountain Resort Corporation Group Co.,Ltd.,Pingquan 067500,China)

Pyrazines of Luzhou-flavor“Shan-Zhuang Lao-Jiu”were analyzed by liquid-liquid extraction coupled with GC-MS.Eight pyrazines were qualitative identified,which were 2-methylpyrazine,2,5-dimethylpyrazine,2,6-dimethylpyrazine,2,3-dimethylpyrazine,2-ethyl-6-methylpyrazine, trimethylpyrazine,2-ethyl-3,5-dimethylpyrazine and tetramethylpyrazine.Among them,six common pyrazines were quantitative analyzed.Results showed that the content of 2,6-dimethylpyrazine was the highest,which was 504.64 μg/L.The contents of trimethylpyrazine and tetramethylpyrazine were higher than 100 μg/L,and the content of 2-methylpyrazine and 2,3-dimethylpyrazine was 33.14 μg/L and 22.48 μg/L,respectively.

liquid-liquid extraction;GC-MS;Luzhou-flavor liquor;pyrazines

TS262.3

A

0254-5071（2015）04-0146-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.033

2015-03-27

天津科技大学青年教师创新基金（2014CXLG09）

王国明（1965-），男，高级工程师，本科，研究方向为白酒生产。

*通讯作者：杜丽平（1967-），女，副教授，博士，研究方向为发酵工程与分离工程。