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青海不同产地唐古特大黄的脂肪酸成分及其主成分分析

2015-01-25孙胜男叶润蓉卢学峰周玉碧舍莉萍

植物资源与环境学报 2015年1期
关键词:不饱和样地脂肪酸

孙胜男, 叶润蓉, 卢学峰, 周玉碧, 舍莉萍, 彭 敏,①

(1. 中国科学院西北高原生物研究所 青海省青藏高原特色生物资源重点实验室, 青海 西宁 810008; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

青海不同产地唐古特大黄的脂肪酸成分及其主成分分析

孙胜男1,2, 叶润蓉1, 卢学峰1, 周玉碧1, 舍莉萍1,2, 彭 敏1,①

(1. 中国科学院西北高原生物研究所 青海省青藏高原特色生物资源重点实验室, 青海 西宁 810008; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

采用柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)对来源于青海省甘德、达日、班玛、玛沁、同德和祁连6个县15个样地的唐古特大黄(RheumtanguticumMaxim. ex Balf.)地下部分的脂肪酸成分进行了检测和分析,并在此基础上对脂肪酸成分进行了主成分分析。结果显示:从各产地唐古特大黄中均检测出15种脂肪酸成分,包括12种饱和脂肪酸(即癸酸、十一酸、十二酸、十四酸、十五酸、棕榈酸、硬脂酸、二十酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸和二十四酸)和3种不饱和脂肪酸(即亚麻酸、亚油酸和油酸),其中,饱和脂肪酸中棕榈酸含量最高、不饱和脂肪酸中亚油酸含量最高。不同产地唐古特大黄的总脂肪酸含量为2.38~54.22 μg·g-1,其中不饱和脂肪酸占17.31%~48.97%;各脂肪酸成分存在明显的地域性差异,产自玛沁县MQ1样地的样品中总脂肪酸含量最高,产自祁连县QL2样地的样品中不饱和脂肪酸所占比例最高。主成分分析结果显示:前3个主成分的累计贡献率较高,达到87.387%,其中特征向量较大的脂肪酸均为偶数长碳链脂肪酸(碳原子数大于12),表明偶数长碳链脂肪酸为唐古特大黄的特征性脂肪酸成分。综合分析结果表明:青海省不同地域复杂多变的地理和气候条件可能是造成唐古特大黄脂肪酸组成及含量差异的主要因素。

唐古特大黄; 脂肪酸成分; HPLC-FLD; 柱前衍生; 主成分分析

唐古特大黄(RheumtanguticumMaxim. ex Balf.)又名鸡爪大黄,为蓼科(Polygonaceae)大黄属(RheumLinn.)多年生高大草本植物,主要分布于海拔2 300~4 200 m的林缘、林下沟谷或灌丛地带[1]。唐古特大黄为中药材大黄的原植物之一,青海省是其著名的道地药材产区。大黄的药用历史悠久,具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄等功效[2]。已有的研究结果表明:大黄属植物含有多种化学成分,但主要集中在蒽醌类、鞣质类、二苯乙烯类及苯丁酮类等药用活性成分[3-5]。

脂肪酸广泛分布于动植物体内,在机体能量供应方面具有重要作用,其中,不饱和脂肪酸因具有调节血脂、降低血糖、增强免疫力等功能更受到人们的日益重视[6]。迄今为止,仅见在进行大黄挥发油组分测定时有部分脂肪酸成分的研究报道[7-8],并未见针对其脂肪酸成分的详细分析报道。因此,对大黄脂肪酸成分进行系统分析对于大黄资源的充分利用具有重要意义。

目前,一般采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)测定植物的脂肪酸成分,该方法效率高、应用范围较广,但存在灵敏度欠佳、重现性不理想等缺点[9];相较而言,采用高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)分析植物的脂肪酸成分则具有较高的灵敏度和稳定性[10]。鉴于此,作者以苯并[b]吖啶酮-5-乙基对甲苯磺酸酯(BAETS)[11]作为标记分子,采用柱前衍生HPLC-FLD法对来源于青海省甘德、达日、班玛、玛沁、同德和祁连6个县15个样地的唐古特大黄的脂肪酸成分进行了测定和分析,采用主成分分析法研究了其特征性脂肪酸成分,并对脂肪酸含量的地域性差异进行了初步探讨,以期为唐古特大黄的化学成分研究及其资源的深度开发和合理利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

于2011年10月在唐古特大黄的自然分布区青海省甘德县、达日县、班玛县、玛沁县、同德县和祁连县分别选取2、5、2、2、1和3个样地,共15个样地;各样地均挖取5株大黄植株的根及根茎部分,洗净、烘干、混合,粉碎并过80目筛,备用。原植物标本经中国科学院西北高原生物研究所卢学峰副研究员鉴定。

主要仪器有Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、Hypersil BDS C8色谱柱 (200 mm × 4.6 mm,5 μm,Dalian Elite)、KQ118型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)和BF2000型氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司)。主要试剂有15种饱和脂肪酸标准品(购自上海试剂厂),4种不饱和脂肪酸标准品(购自Sigma公司),光谱纯乙腈(购自Sigma公司),超纯水,乙醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和K2CO3等试剂均为分析纯,衍生试剂BAETS由曲阜师范大学生命有机分析重点实验室合成。

1.2 方法

1.2.1 HPLC分析条件 荧光激发和发射波长分别为272和505 nm;柱温30 ℃;流速1.0 mL·min-1;进样量10 μL。流动相A为体积分数5%的乙腈溶液,流动相B为纯乙腈。梯度洗脱程序为:0~25 min,50%~90%A; 25~28 min, 90%~92%A; 28~30 min,92%~100%A;30~40 min,100%A。脂肪酸标准品衍生物的质谱定性参照文献[10]确定。

1.2.2 脂肪酸标准品混合液的制备和标准曲线的绘制 分别称取一定质量的各脂肪酸标准品,加入相应体积的纯乙腈并摇匀,制成浓度为0.01 mol·L-1的单一脂肪酸标准品溶液;将15个单一的脂肪酸标准品溶液混合并稀释成浓度为0.1 mmol·L-1的脂肪酸标准品混合液,逐级稀释2、4、8、16和32倍,备用。

称取适量的BAETS,用纯乙腈制成浓度为0.03 mmol·L-1的衍生试剂溶液;向装有约20 mg无水K2CO3粉末的安瓿瓶中依次加入40 μL稀释后的系列浓度脂肪酸标准品混合液、200 μL DMF和200 μL衍生试剂溶液,封口后置于90 ℃恒温水浴中反应30 min;冷却后加入体积分数30%乙腈溶液并稀释至1 mL,摇匀后进行HPLC分析。以峰面积为自变量x、进样浓度为因变量y进行线性回归分析,得到各脂肪酸标准品的线性回归方程,结果表明各脂肪酸均在0.125~4.000 μmol·L-1范围内存在线性关系,相关系数均高于0.998 3。

1.2.3 样品溶液的制备和分析 分别称取50 mg各样地的唐古特大黄样品粉末,准确加入5 mL无水乙醇,在20 ℃条件下超声(功率70 W)提取2 h并浸泡过夜;室温下于4 000 r·min-1离心40 min;取1 mL上清液,用氮气吹干后按照上述方法进行衍生化处理,并采用上述色谱条件进行HPLC分析。分别记录各样品的峰面积并根据各脂肪酸的线性回归方程计算每个样品中各个脂肪酸成分的含量。

1.3 方法学考察

1.3.1 精密度实验 取经过衍生化的脂肪酸标准品混合液(0.1 mmol·L-1),采用上述色谱条件连续进样6次。各脂肪酸峰面积的RSD值为0.29%~2.32%,说明该分析方法精密度良好。

1.3.2 重复性实验 取来源于甘德县GD1样地的唐古特大黄样品3份,分别按上述方法制备样品溶液,并采用上述色谱条件进行HPLC分析。各脂肪酸峰面积的RSD值为0.95%~7.36%,说明该分析方法重复性较好。

1.3.3 稳定性实验 取经过衍生化的甘德县GD1样地唐古特大黄样品溶液,分别于室温下放置0、16、24和48 h后采用上述色谱条件进行HPLC分析。经计算,放置0、16和24 h后各脂肪酸成分的RSD值小于5.83%,而放置0、24和48 h后各脂肪酸成分的RSD值小于7.22%,说明该溶液日内和日间的稳定性均较差,应该在经过衍生化处理后立刻进行HPLC分析。

1.3.4 加样回收率实验 称取来源于甘德县GD1样地的唐古特大黄样品3份,分别按上述方法制备样品溶液,并按照上述方法进行衍生化处理后,准确加入0.1 mmol·L-1脂肪酸标准品混合溶液100 μL,采用上述色谱条件进行HPLC分析。各脂肪酸成分的加样回收率为85.28%~105.27%,RSD值为0.90%~2.79%。

1.4 数据统计分析

采用EXCEL 2010软件进行各脂肪酸成分的含量计算和相关数据的整理,并采用PC-ORD 5.0统计分析软件对不同产地唐古特大黄的各脂肪酸成分含量进行主成分分析。

2 结果和分析

2.1 HPLC检测结果分析

采用HPLC法对19个脂肪酸标准品混合液和唐古特大黄样品中的脂肪酸成分进行了测定分析,结果表明:脂肪酸标准品混合液中的19个脂肪酸分离效果较好(图1-A),唐古特大黄样品中的脂肪酸成分分离效果也较好,与脂肪酸标准品混合液的HPLC图谱比较,共检测出15个脂肪酸成分(图1-B)。

2.2 不同产地唐古特大黄中脂肪酸成分的比较

不同产地唐古特大黄中脂肪酸成分含量的比较结果见表1。检测结果表明:从来源于不同样地的唐古特大黄样品中均检测出癸酸、十一酸、十二酸、十四酸、十五酸、棕榈酸、硬脂酸、二十酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸和二十四酸12种饱和脂肪酸以及亚麻酸、亚油酸和油酸3种不饱和脂肪酸,仅十三酸、花生四烯酸、十七酸和十九酸未检出。

由表1可见:来源于15个样地的唐古特大黄样品中总脂肪酸含量为2.38~54.22 μg·g-1,其中,总饱和脂肪酸含量为1.71~29.07 μg·g-1,总不饱和脂肪酸含量为0.67~25.15 μg·g-1,总不饱和脂肪酸含量占总脂肪酸含量的17.31%~48.97%。含量较高的脂肪酸依次是亚油酸、棕榈酸、亚麻酸、硬脂酸,平均含量均高于1.00 μg·g-1,这4种脂肪酸的总含量占总脂肪酸含量的65.44%;癸酸的平均含量最低,仅为0.19 μg·g-1。

由表1还可见:唐古特大黄样品中的各脂肪酸成分含量在不同样地间差异较大。变幅最大的为亚油酸,变异系数达114.77%;变幅最小的为二十一酸,变异系数为44.70%。来源于玛沁县MQ1样地的唐古特大黄样品的总脂肪酸含量最高,为54.22 μg·g-1;来源于祁连县QL2样地的唐古特大黄样品中总不饱和脂肪酸含量所占比例最高,达48.97%。

1: 癸酸Decanoic acid; 2: 十一酸Undecanoic acid; 3: 十二酸Dodecanoic acid; 4: 十三酸Tridecanoic acid; 5: 亚麻酸Linolenic acid; 6: 十四酸Myristic acid; 7: 花生四烯酸Arachidonic acid; 8: 亚油酸Linoleic acid; 9: 十五酸Pentadecanoic acid; 10: 棕榈酸Palmitic acid; 11: 油酸Oleic acid; 12: 十七酸Heptadecanoic acid; 13: 硬脂酸Octadecanoic acid; 14: 十九酸Nonadecanoic acid; 15: 二十酸Arachidic acid; 16: 二十一酸Heneicosoylic acid; 17: 二十二酸Docosanoic acid; 18: 二十三酸Tricosanoic acid; 19: 二十四酸Tetracosanoic acid.

图1 脂肪酸标准品混合液(A)及唐古特大黄样品(B)中脂肪酸成分的HPLC图谱

Fig. 1 HPLC chromatograms of fatty acid compositions in fatty acid standard mixture solution (A) and in sample ofRheumtanguticumMaxim. ex Balf. (B)

表1 青海省不同产地唐古特大黄样品中脂肪酸成分含量的比较

Table 1 Comparison on content of fatty acid composition inRheumtanguticumMaxim. ex Balf. from different locations of Qinghai Province

续表1 Table 1 (Continued)

1)GD: 甘德县Gande County; DR: 达日县Dari County; BM: 班玛县Banma County; MQ: 玛沁县Maqin County; TD: 同德县Tongde County; QL: 祁连县Qilian County; M: 平均值 Mean;CV: 变异系数 Coefficient of variation.

2)DEA: 癸酸Decanoic acid; UNA: 十一酸Undecanoic acid; DOA: 十二酸Dodecanoic acid; LIA: 亚麻酸Linolenic acid; MYA: 十四酸Myristic acid; LA: 亚油酸Linoleic acid; PEA: 十五酸Pentadecanoic acid; PAA: 棕榈酸Palmitic acid; OLA: 油酸Oleic acid; OCA: 硬脂酸Octadecanoic acid; ARA: 二十酸Arachidic acid; HEA: 二十一酸Heneicosylic acid; DA: 二十二酸Docosanoic acid; TRA: 二十三酸Tricosanoic acid; TEA: 二十四酸Tetracosanoic acid; Ts: 总饱和脂肪酸Total saturated fatty acids; Tu: 总不饱和脂肪酸Total unsaturated fatty acids; T: 总脂肪酸Total fatty acids.

2.3 唐古特大黄中脂肪酸成分的主成分分析

以15个样地的唐古特大黄样品为样本单元、15个脂肪酸成分含量为变量进行主成分分析,结果见表2。结果显示:前3个主成分的累计贡献率达到87.387%,说明这3个主成分可以基本反映唐古特大黄样品中所有脂肪酸成分的信息。其中,第1主成分的贡献率达67.673%,说明该主成分可解释总信息量的三分之二,特征向量较大的是十二酸、亚麻酸、十四酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸,均为偶数碳链脂肪酸,且均为长碳链脂肪酸(碳原子数大于12);第2和第3主成分的贡献率分别为12.450%和7.264%,二者特征向量最大的分别为二十三酸和二十酸。

表2 青海产唐古特大黄脂肪酸成分含量的主成分分析1)

Table 2 Principal component analysis on content of fatty acid composition inRheumtanguticumMaxim. ex Balf. from Qinghai Province1)

1)DEA: 癸酸Decanoic acid; UNA: 十一酸Undecanoic acid; DOA: 十二酸Dodecanoic acid; LIA: 亚麻酸Linolenic acid; MYA: 十四酸Myristic acid; LA: 亚油酸Linoleic acid; PEA: 十五酸Pentadecanoic acid; PAA: 棕榈酸Palmitic acid; OLA: 油酸Oleic acid; OCA: 硬脂酸Octadecanoic acid; ARA: 二十酸Arachidic acid; HEA: 二十一酸Heneicosylic acid; DA: 二十二酸Docosanoic acid; TRA: 二十三酸Tricosanoic acid; TEA: 二十四酸Tetracosanoic acid; E: 特征值 Eigen value; R: 贡献率Contribution rate; AR: 累计贡献率 Accumulative contribution rate.

3 讨论和结论

脂肪酸是生物膜的主要组成成分,也是许多生化反应的前体物质,在维持生物体功能和新陈代谢方面有重要作用,特别是不饱和脂肪酸具有显著的生理活性,在降低血糖、调节血脂、降低血清胆固醇等方面具有一定的功效[12]。本研究采用柱前衍生HPLC-FLD法从唐古特大黄中共检出15种脂肪酸成分,其中,饱和脂肪酸以棕榈酸含量最高、硬脂酸含量次之;3种不饱和脂肪酸的含量由高到低依次是亚油酸、亚麻酸和油酸。主成分分析结果显示:偶数长碳链脂肪酸为唐古特大黄的特征性脂肪酸成分,这与青海高原其他根茎类药材脂肪酸成分的测定结果[13-14]一致。推测唐古特大黄的脂肪酸组成可能与其具有降糖、降脂和抗血栓作用有关,其脂肪酸组成的药理学原理有待深入研究。

药用资源化学成分的种类及含量的地域性差异是中药材道地性的一种具体体现[15-16]。测定结果显示:青海产唐古特大黄的各脂肪酸成分含量在不同样地间变化较大。本研究使用的唐古特大黄样品来自青海高原东部的南起班玛县、北至祁连县的6个县,纬度跨度达5.4°,受复杂多变的气候因素和地理环境的影响,植物体内的化学成分含量差异很大。采自玛沁县MQ1样地的唐古特大黄样品的总脂肪酸含量最高,这可能与玛沁县的地理和气候条件有关。该县地处青海高原南端,平均海拔在4 000 m以上,地势较高、气候寒冷,属高原大陆性半湿润气候,这种特殊的气候条件有利于唐古特大黄体内脂肪酸的积累。不饱和脂肪酸含量所占比例以来源于祁连县QL2样地的唐古特大黄样品最高。祁连县地处青海高原北部祁连山脉的山间谷地,海拔在3 000 m左右,气候温暖湿润、光照充足,这些地理和气候条件符合唐古特大黄耐寒喜湿的特性,可能有利于其体内不饱和脂肪酸的积累。由于植物体内化学成分的积累受遗传和外界环境等多方面因素的影响,因而,关于唐古特大黄脂肪酸成分与其生态环境因子的相关性还需进行深入研究。

结果表明:青海省各产地唐古特大黄的脂肪酸含量具有较明显的地域性差异。因此,在对青海产唐古特大黄的脂肪酸资源进行开发应用时,可根据实际需要选择产地。例如,若注重总脂肪酸的利用,可采集玛沁县的样品;若主要应用不饱和脂肪酸,则可选择祁连县的样品。

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(责任编辑: 佟金凤)

Analyses on fatty acid composition inRheumtanguticumfrom different locations in Qinghai and its principal component analysis

SUN Shengnan1,2, YE Runrong1, LU Xuefeng1, ZHOU Yubi1, SHE Liping1,2, PENG Min1,①

(1. Qinghai Key Laboratory of Qinghai-Tibet Plateau Biological Resources, NorthwestInstituteofPlateauBiology,ChineseAcademyofSciences,Xining810008, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China),

J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(1): 48-53

Fatty acid composition in under-ground part ofRheumtanguticumMaxim. ex Balf. from fifteen plots of six counties of Gande, Dari, Banma, Maqin, Tongde and Qilian in Qinghai Province were determined and analyzed by the method of high performance liquid chromatography-fluorescence detection (HPLC-FLD) with pre-column derivatization, and on this basis, principal component analysis on fatty acid composition was carried out. The results show that all of fifteen fatty acids are detected inR.tanguticumfrom different locations, which includes twelve saturated fatty acids (viz. decanoic acid, undecanoic acid, dodecanoic acid, myristic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, octadecanoic acid, arachidic acid, heneicosylic acid, docosanoic acid, tricosanoic acid and tetracosanoic acid) and three unsaturated fatty acids (viz. linolenic acid, linoleic acid and oleic acid). In which, palmitic acid content is the highest in saturated fatty acids, and linoleic acid content is the highest in unsaturated fatty acids. The content of total fatty acids inR.tanguticumfrom different locations is 2.38-54.22 μg·g-1, in which, unsaturated fatty acids account for 17.31%-48.97%. There is an obvious regional difference in fatty acid compositions. The content of total fatty acids in sample from MQ1 plot of Maqin County is the highest, and the proportion of unsaturated fatty acids in sample from QL2 plot of Qilian County is the highest. The result of principal component analysis shows that accumulative contribution rate of the first three principal components is high with a value of 87.387%, in which, fatty acids with high eigenvector are all even number and long carbon chain fatty acids (with carbon atom number being higher than 12), meaning that even number and long carbon chain fatty acids are characteristic fatty acid composition ofR.tanguticum. Comprehensive analysis result indicates that complex and changeable climate and geographical conditions of different regions in Qinghai Province are probably the main factors to cause differences in composition and content of fatty acids inR.tanguticum.

RheumtanguticumMaxim. ex Balf.; fatty acid composition; HPLC-FLD; pre-column derivatization; principal component analysis

2014-04-17

“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAC08B06)

孙胜男(1988—),女,山东威海人,博士研究生,主要从事植物资源品质评价的相关研究。

①通信作者 E-mail: pengmin@nwipb.cas.cn

Q946.1; R284.1

A

1674-7895(2015)01-0048-06

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.01.07

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