张志勤，项国仕(综述)， 黄孝天(审校)

肠道病毒71型VP1蛋白研究进展

张志勤，项国仕(综述)， 黄孝天(审校)

肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)为手足口病的主要病原体。目前，手足口病的发病机制并不完全清楚，临床上缺乏有效的疫苗及特异性治疗药物。作为EV71主要衣壳蛋白，VP1在EV71的吸附和穿入过程中起着重要作用。另一方面，VP1上存在特异性中和性抗原表位，在EV71疫苗研究中占有重要地位。本文主要概括EV71 VP1结构、功能及与之相关疫苗的研究进展。

手足口病;肠道病毒71型;衣壳蛋白

据2013年国际病毒分类委员会最新分类，EV71属于小RNA病毒科肠道病毒属A种肠道病毒。病毒颗粒呈球形, 无包膜, 衣壳为二十面体立体对称, 由60个相同的亚单位构成, 每个亚单位均包含VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白。EV71为手足口病的主要病原体之一，由EV71引起的手足口病大部分是轻微及自限性的，但仍有部分患者的病情进展为重症神经系统疾病及致命性脑炎。Yu[1]等通过2008-2012年中国手足口病流行病学调查显示，80%以上的重症病例以及90%以上的死亡病例由EV71感染所致。VP1作为EV71的结构蛋白，且EV71主要的中和抗原决定簇集中于VP1上，因此具有重要的研究意义。

1 EV71 VP1结构

EV71 VP1蛋白包含297个氨基酸(amino acid, aa)，大小为32 kD。晶体结构显示，VP1具有 “果冻卷”型的β-桶状结构，这种桶状结构包括8个β-折叠，分别排列于2个β-片层中，每个片层包含4个β折叠，其中1、8、3、6 β-折叠 形成一个β片层，而2、7、4、5 β-折叠形成另外一个β片层。VP1中还包括另一个重要的结构：疏水性口袋因子。此结构在EV71和其他肠道病毒中存在不同，在EV71中，口袋因子有约40 Å2的表面积，主要暴露在VP1五聚体周围的峡区的表面，并经VP1 β桶状结构直达深处，其中包含天然脂质成分[2-3]，而在其他肠道病毒中，口袋因子是被完全包埋的。病毒表面，VP1 β桶状结构区存在一个深凹，此凹陷被认为是EV71病毒的粘附位点，也被称为峡谷样结构(canyon)[4]。EV71衣壳内表面结构与其他肠道病毒也存在差异，这种差异通常表现在VP1上，肠道病毒中VP1第1-28 aa通常朝向五重旋转对称轴，而在EV71中转向了另一侧。

小RNA病毒中可变性最强的结构为暴露于病毒表面的茎环结构(loop)，EV71病毒中VP1上存在BC、DE、βE/αB、GF、GH、HI等6个茎环结构，其中BC、DE及HI茎环结构为扁平并远离二十面体的五重旋转对称轴，BC(96-102 aa)及GH 茎环结构(208-222 aa)是暴露于最外围的[3]，此外DE茎环结构和EF茎环结构定位于峡谷样结构表面，由于EV71 VP1的茎环结构比其他肠道病毒的更小，导致了EV71的峡谷样结构比其他的肠道病毒更浅[5]。Chen等报道EV71安徽阜阳株与EV71-1095株VP1的GH环状结构存在不同，而SCARB2的结合域VP1第172位aa(位于峡谷样结构区)却没有观察到不同[6]，这表明在不同的EV71病毒株间峡谷样区域可能保守。

2 EV71 VP1功能

EV71 VP1与其他肠道病毒及其他小RNA病毒结构上的差异均可能导致其功能独具特性。EV71 VP1作为病毒结构蛋白，其主要功能为协助病毒感染，结合细胞受体。目前，包括多个与EV71相互作用的细胞受体被鉴定[7-12]，其中与VP1相关的包括清道夫受体B2(Scavenger receptor class B, member 2,SCARB2)、选择素P糖蛋白配体1(P-selectin Glycoprotein Ligand,PSGL-1)、人膜联蛋白II(human annexin II,Anx2)以及硫酸乙酰肝素类糖胺聚糖(Heparan Sulfate Glycosaminoglycan)。SCARB2是主要表达于核内体及溶酶体膜的III型糖蛋白，EV71与SCARB2的作用是通过结合到VP1的Gln-172周围的canyon结构来达到病毒感染的目的，SCARB2的第4个外显子与这种相互作用有关，尤其在酸性条件下，这种作用使完整的病毒体(160S)变成135S的A颗粒，A颗粒被认为是完整病毒体与脱壳后病毒的中间物[7]。PSGL-1表达于骨髓细胞及受激后的T淋巴细胞，作为细胞粘附因子P、E、L高亲和性配体，EV71 VP1与白细胞PSGL-1的相互作用由VP1-145的分子开关控制，病毒表面赖氨酸与硫酸化PSGL-1的N-末端酪氨酸相互作用，而VP1-145作为一个开关，通过调节VP1-244K的转向来调控VP1与PSGL-1的结合，这种作用使EV71更倾向与表达PSGL-1的白细胞结合。同时PSGL-1与白细胞迁移，细胞因子产生及免疫反应的调控有关[8,11]，这可能介导病毒在体内的播散，此外过度炎症因子的产生，将导致严重疾病的发生。Anx2是膜联蛋白家族的一员。其除通过钙离子结合区域(α螺旋核心区域)与磷脂膜的相互作用外,还与多种细胞因子作用参与调节细胞功能,如内吞及胞吐等过程。在EV71感染过程中，Anx2则是通过与EV71 VP1上第40-100位 aa相互作用来增加病毒感染能力的，这种相互作用在低感染剂量时尤为明显[10]。Tan[12]等研究表明表达于细胞表面的糖胺聚糖中的硫酸乙酰肝素也能作为EV71受体，使用多聚赖氨酸中和细胞表面阴离子及通过抗硫酸乙酰肝素多肽封闭细胞表面硫酸乙酰肝素均能抑制EV71的感染，同时他们还使用三维建模来了解EV71上硫酸乙酰肝素可能的结合位点。总之，EV71通过不同的受体感染不同细胞。

除结合宿主受体外，EV71 VP1还能自身结合形成二聚体，形成这种二聚体的主要活性区域位于第66-132位 aa。VP1二聚体的形成导致其三级结构更加稳定，同时使病毒衣壳蛋白的结构更加简洁紧凑，这有助于病毒的穿入及释放[13]。

另外，有研究表明[14]，VP1能激活钙调素依赖性蛋白激酶II(calmodulin-dependent protein kinase II ,CaMK-II)。CaMK-II存在于许多动物细胞内，尤其在神经组织中含量丰富。正常生理状态下，CaMK-II在转录调节、骨架蛋白的磷酸化以及学习记忆等过程起重要作用。EV71感染后，CaMK-II磷酸化波形蛋白(Vimentin)N端第82位丝氨酸，而波形蛋白的磷酸化及aggresomes的形成是病毒复制所需要的。具体的作用模式为：被EV71感染的细胞内合成的VP1蛋白介导了CaMK-II Thr286的磷酸化激活CaMK-II，激活的CaMK-II再磷酸化波形蛋白细丝(filament)Ser82，引起波形蛋白细丝的分解，VP1结合被分解的波形蛋白并被转运至核周开始形成病毒复制中心。复制中心的形成为病毒基因组的合成提供平台，这表明VP1在病毒复制过程中扮演着重要的角色。

此外，VP1还能与乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)相互作用[15]，研究发现LF能抑制EV71感染，具体作用机制可能为LF封闭细胞受体或者直接与病毒颗粒结合，从而防止病毒结合受体进入细胞引起感染。尽管LF未被批准作为治疗EV71的药物，但可将其考虑为抑制病毒进入细胞的一种药物，辅助治疗EV71感染。

EV71 VP1晶体结构及其在基因型间的差异[2-3, 16]均有报道，而一些有关VP1在EV71病毒生物学行为中的作用也提出相应的模式，如作为RNA释放的传感器[3]等，而这些模式的确证都需要我们通过更多的实验来证实。

3 EV71 VP1相关疫苗研究

EV71疫苗研究涉及灭活疫苗、减毒活疫苗、DNA疫苗、重组疫苗、多肽疫苗等。而VP1作为主要抗原蛋白则多应用于抗原表位疫苗、重组疫苗研究，目前已经有许多研究[17-23]在动物水平证实了VP1蛋白及其多肽能有效的预防EV71感染。

抗原表位疫苗方面，Guang等[22]应用覆盖VP1全长的95条合成多肽免疫小鼠，获得2个保守的线性化的中和抗原表位SP55 ( 163～177 aa)和SP70 (208～222 aa)，这两个表位在不同的EV71基因亚型间高度保守，尤其是SP70，几乎在所有EV71基因亚型间均相同，表明其可作为开发EV71疫苗的抗原表位。此外，Lim等[23-24]发现VP1最小抗原决定簇位于215-219 aa及N端12-19 aa。重组疫苗方面，Chen等[18]用转基因鼠(VP1+/+)产的包含VP1蛋白的奶，喂养腹腔注射EV71的幼鼠，发现外源VP1蛋白能起到保护幼鼠作用，表明VP1口服疫苗在理论上是有效和可行的。在重组VP1蛋白疫苗研究方面，Cao[17]等用枯草杆菌作为载体将VP1融合其衣壳蛋白COTB蛋白生产表达VP1蛋白的疫苗，结果表明重组的疫苗能引起细胞及体液免疫，这为低成本的疫苗制备提供了线索，同时Chen[25]等利用转基因西红柿表达EV71 VP1蛋白作为口服疫苗，实验证实，在BALB/C小鼠粪便中能检测到VP1特异性IgA同时血液中也能检测到VP1特异性IgG，且服用此口服疫苗的小鼠的血清能抑制EV71对横纹肌肉瘤细胞(RD cells)的感染，这为转基因西红柿作为口服疫苗来预防EV71的可行性提供了实验及理论基础。

4 展 望

在EV71感染过程中，VP1蛋白承担着重要的角色，参与吸附、穿入、脱壳等过程，实验研究表明针对VP1设计的疫苗能保护实验动物，能抑制EV71感染或减轻感染后症状，这为EV71疫苗开发提供了实验及理论基础。

至今仍未有EV71特效药及有效的疫苗应用于临床，加速EV71致病机制的研究及有效疫苗的开发将成为EV71研究的一项重要内容。欣慰的是，中国已研制出的灭活疫苗并对疫苗III期临床试验阶段的疗效、安全性及免疫原性做了详细的评估[26-27]，这将为我们抵御这种传染病提供有力的武器。

[1]Xing W, Liao Q, Viboud C, et al. Hand, foot, and mouth disease in China, 2008-12: an epidemiological study[J]. Lancet Infect Dis, 2014, 14(4): 308-318. DOI: 10.1016/S1473-3099(13)70342-6

[2]Plevka P, Perera R, Cardosa J, et al. Crystal structure of human enterovirus 71[J]. Science, 2012, 336(6086): 1274-1274. DOI: 10.1126/science.1218713

[3]Wang X, Peng W, Ren J, et al. A sensor-adaptor mechanism for enterovirus uncoating from structures of EV71[J]. Nat Struct Mol Biol, 2012, 19(4): 424-429. DOI: 10.1038/nsmb.2255

[4]Ke YY, Chen YC, Lin TH. Structure of the virus capsid protein VP1 of enterovirus 71 predicted by some homology modeling and molecular docking studies[J]. J Computat Chem, 2006, 27(13): 1556-1570. DOI: 10.1002/Jcc.20460

[5]Miyamura K, Nishimura Y, Abo M, et al. Adaptive mutations in the genomes of enterovirus 71 strains following infection of mouse cells expressing human P-selectin glycoprotein ligand-1[J]. J General Virol, 2011, 92(2): 287-291.

[6]Chen P, Song ZL, Qi YH, et al. Molecular determinants of enterovirus 71 viral entry cleft around gln-172 on vp1 protein interacts with variable region on scavenge receptor b 2[J]. J Biologic Chem, 2012, 287(9): 6406-6420. DOI: 10.1074/jbc.M111.301622

[7]Yamayoshi S, Yamashita Y, Li JF, et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71[J]. Nat Med, 2009, 15(7): 798-801. DOI: 10.1038/nm.1992.Epub 2009 Jun 21.

[8]Nishimura Y, Shimojima M, Tano Y, et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71[J]. Nat Med, 2009, 15(7): 794-797. DOI: 10.1038/nm.1961.Epub 2009 Jun 21.

[9]Yang B, Chuang H, Yang KD. Sialylated glycans as receptor and inhibitor of enterovirus 71 infection to DLD-1 intestinal cells[J]. Virol J, 2009, 6(141): 1-6. DOI: 10.1186/1743-422x-6-141

[10]Yang SL, Chou YT, Wu CN, et al. Annexin II binds to capsid protein VP1 of enterovirus 71 and enhances viral infectivity[J]. J Virol, 2011, 85(22): 11809-11820. DOI: 10.1128/JVI.00297-11

[11]Nishimura Y, Lee H, Hafenstein S, et al. Enterovirus 71 binding to PSGL-1 on leukocytes: VP1-145 acts as a molecular switch to control receptor interaction[J]. PLoS Pathogens, 2013, 9(7): e1003511-e1003511. DOI: 10.1371/journal.ppat.1003511

[12]Tan CW, Poh CL, Sam IC, et al. Enterovirus 71 uses cell surface heparan sulfate glycosaminoglycan as an attachment receptor[J]. J Virol, 2013, 87(1): 611-620. DOI: 10.1128/JVI.02226-12

[13]Lal SK, Kumar P, Yeo WM, et al. The VP1 protein of human enterovirus 71 self-associates via an interaction domain spanning amino acids 66-297[J]. J Med Virol, 2006, 78(5): 582-590. DOI: 10.1002/Jmv.20579

[14]Haolong C, Du N, Hongchao T, et al. Enterovirus 71 VP1 activates calmodulin-dependent protein kinase II and results in the rearrangement of vimentin in human astrocyte cells[J]. PLoS One, 2013, 8(9): e73900-e73900. DOI: 10.1371/journal.pone.0073900

[15]Weng TY, Chen LC, Shyu HW, et al. Lactoferrin inhibits enterovirus 71 infection by binding to VP1 protein and host cells[J]. Antiviral Res, 2005, 67(1): 31-37. DOI: 10.1016/j.antiviral.2005.03.005[16]Cifuente JO, Lee H, Yoder JD, et al. Structures of the procapsid and mature virion of Enterovirus 71 strain 1095[J]. J Virol, 2013, 87(13): 7637-7645. DOI: 10.1128/Jvi.03519-12

[17]Cao YG, Li ZH, Yue YY, et al. Construction and evaluation of a novel Bacillus subtilis spores-based enterovirus 71 vaccine[J]. J Appl Biomed, 2013, 11(2): 105-113. DOI: 10.2478/v10136-012-0032-9

[18]Chen HL, Huang JY, Chu TW, et al. Expression of VP1 protein in the milk of transgenic mice: A potential oral vaccine protects against enterovirus 71 infection[J]. Vaccine, 2008, 26(23): 2882-2889. DOI: 10.1016/j.vaccine.2008.03.041

[19]Kiener TK, Premanand B, Kwang J. Immune responses to baculovirus-displayed enterovirus 71 VP1 antigen[J]. Expert Rev Vaccines, 2013, 12(4): 357-364. DOI: 10.1586/Erv.13.18

[20]Meng T, Kolpe AB, Kiener TK, et al. Display of VP1 on the surface of baculovirus and its immunogenicity against heterologous human Enterovirus 71 strains in mice[J]. PLoS One, 2011, 6(7): e21757-e21757. DOI: 10.1371/journal.pone.0021757

[21]Sivasamugham LA, Cardosa MJ, Tan WS, et al. Recombinant Newcastle disease virus capsids displaying enterovirus 71 VP1 fragment induce a strong immune response in rabbits[J]. J Med Virol, 2006, 78(8): 1096-1104. DOI: 10.1002/Jmv.20668

[22]Guang D, Foo W, Alonso S, et al. Identification of neutralizing linear epitopes from the VP1 capsid protein of Enterovirus 71 using synthetic peptides[J]. Virus Res, 2007, 125(1): 61-68. DOI: 10.1016/j.virusres.2006.12.005

[23]Lim XF, Jia Q, Chow VTK, et al. Characterization of a novel monoclonal antibody reactive against the N-terminal region of Enterovirus 71 VP1 capsid protein[J]. J Virologic Methods, 2013, 188(1-2): 76-82. DOI: 10.1016/j.jviromet.2012.11.038

[24]Lim XF, Jia Q, Khong WX, et al. Characterization of an isotype-dependent monoclonal antibody against linear neutralizing epitope effective for prophylaxis of enterovirus 71 infection[J]. PLoS One, 2012, 7(1): e29751.

[25]Chen HF, Chang MH, Chiang BL, et al. Oral immunization of mice using transgenic tomato fruit expressing VP1 protein from enterovirus 71[J]. Vaccine, 2006, 24(15): 2944-2951. DOI: 10.1016/j.vaccine.2005.12.047

[26]Zhu F, Xu W, Xia J, et al. Efficacy, safety, and immunogenicity of an enterovirus 71 vaccine in China[J]. N Engl J Med, 2014, 370(9): 818-828.

[27]Li R, Liu L, Mo Z, et al. An inactivated enterovirus 71 vaccine in healthy children[J]. N Engl J Med, 2014, 370(9): 829-837. DOI: 10.1056/NEJMoa1303224

Research progress of enterovirus 71 VP1

ZHANG Zhi-qin,XIANG Guo-shi,HUANG Xiao-tian

(Department of Medical Microbiology, Medical School of Nanchang University, Nanchang 330006, China)

Enterovirus 71 (EV71) is a major causative factor of hand, foot and mouth disease (HFMD). Currently, the mechanism of HFMD is not clearly understood, and neither vaccine nor antiviral therapy is available. As a capsid protein of EV71, VP1 plays an important role during the adsorption and penetration of EV71. The presence of the VP1-specific neutralizing epitopes makes it an important position in the EV71 vaccine research. This review article provides a summary of the structure, function and associated vaccine of EV71 VP1.

hand-foot-mouth disease; enterovirus 71; capsid protein

Huang Xiao-tian, Email:xthuang@ncu.edu.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.018

国家自然科学基金(No. 81160196)，江西省青年科学家培养项目(No.20133BCB23005)

黄孝天，Email: xthuang@ncu.edu.cn

南昌大学医学院微生物学教研室，南昌 330006

R373.2

A

1002-2694(2015)04-0377-03

2014-08-31；

2015-01-30

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81160196) and the Young Scientists Training Program of Jiangxi Province (No. 20133BCB23005)