陈 俊，蒋文灿，2，谭 天，许凯迪，杨丽红

沙门氏菌毒力岛及Ⅲ型分泌系统研究进展

陈 俊1，蒋文灿1，2，谭 天1，许凯迪1，杨丽红1

沙门氏菌(Salmonella)是寄生于人和动物肠道内的革兰氏阴性杆菌，能引起人和动物多种不同临床症状表现，为人类食物中毒主要病原菌之一。沙门氏菌的侵袭力与毒力岛(pathogenicity island，PI)及其编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system，T3SS)直接相关。本文对沙门氏菌毒力岛、T3SS组成、T3SS分泌及调控机制、T3SS与沙门氏菌致病性、应用研究等进行综述，以期为深入研究提供参考。

沙门氏菌；毒力岛；Ⅲ型分泌系统；T3SS

1 沙门氏菌毒力岛

沙门氏菌染色体、质粒上成簇分布的编码毒力相关基因的特定区域称为沙门氏菌毒力岛(Salmonellapathogenicity island，SPI)。目前，已知许多病原细菌，如大肠埃希氏菌、沙门氏菌、李氏杆菌、耶尔森菌、幽门螺杆菌、霍乱弧菌、节瘤拟杆菌、金黄色葡萄球菌等，都存在毒力岛，而且一种病原细菌往往具有1个或多个毒力岛。沙门氏菌已有5个毒力岛研究得比较清楚，分别是SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5。SPI在沙门氏菌入侵肠道上皮细胞过程中扮演重要角色[1]。近年研究人员对沙门氏菌的进一步研究发现了更多的毒力岛，近期陆续报道在伤寒、鼠伤寒、丙型副伤寒等沙门氏菌中新鉴定出SPI6、SPI7、SPI8、SPI9、SPI10、SPI11、SPI12等[2]，进而增加了人们对沙门氏菌及其致病性的认知。

1.1 SPI1 SPI1全长约40 kb，遗传性状稳定，存在于所有沙门氏菌中。已从SPI1中鉴定出39个基因，但并非所有基因都是T3SS所必须，现在已经确定只有29个基因参与编码T3SS。其中，基因inv、hil、org、spt、spa、sip、iag、iac、prg、sic编码T3SS的调节子和分泌性效应蛋白。沙门氏菌T3SS的调节子和分泌性效应蛋白，与沙门氏菌对肠道上皮细胞的定植及侵袭力有关，并可导致巨噬细胞的坏死和炎症反应[3]。其中分泌性效应蛋白参与沙门氏菌粘附于宿主细胞表面，并引起肠黏膜细胞上的肌动蛋白发生重排，从而有利于沙门氏菌内化。Tsuyoshi M等通过敲除鼠伤寒沙门氏菌SL1344菌株SPI1上的基因sipB和sipC发现该菌株体外溶血现象消失，证明sipB和sipC与沙门氏菌体外溶血有关[4]。位于SPI1边缘的4个基因(sitA、sitB、sitC、sitE)编码一个铁摄入系统，对沙门氏菌T3SS的分泌有一定促进作用。SPI1与志贺氏菌毒力质粒上的sqa/mxi/ipa基因结构非常相似。Amit V等研究发现，沙门氏菌SPI1的24个基因表达，及与鞭毛和运动有关的17个基因表达，可被柚皮素抑制[5]。

1.2 SPI2 SPI2全长约40 kb，含40个基因，组成4个操纵子(ssa、ssr、ssc、sse)，其两侧分别是pyykF和valVtRNA基因。SPI2编码的T3SS在结构和功能上同SPI1编码的T3SS均有所区别。ssa编码T3SS成分，ssr编码T3SS调节子，ssc编码T3SS分子伴侣，sse编码T3SS效应蛋白。ssrA具有促进沙门氏菌在鸡生殖系统的定殖作用[6]。SPI2控制沙门氏菌在吞噬细胞和上皮细胞内的复制，并可使沙门氏菌逃避巨噬细胞辅酶Ⅱ信赖的杀伤作用。用信号标签诱变技术(signature-tagged mutagenesis, STM)诱变的都柏林沙门氏菌突变株所做的试验表明，SPI2对犊牛全身性和肠道性沙门氏菌病的发生都有重要作用[7]。SPI2还编码一个双组分调节系统，该系统包括传感蛋白SpiR-SsaA和应答调控蛋白SsrB[8]。其中，SpiR-SsaA具有2个跨膜区，共含920个氨基酸序列；SpiR属于传感蛋白激酶的一种。Vijaya KD等通过利用SPI2上ssaT (780 bp)和sseF (888 bp)2个基因与其它4个基因invA(284 bp)、floR(198 bp),、sulL(425 bp)、tetG(550 bp)建立了一套检测沙门氏菌SPI2及其耐药性的多重PCR[9]。

1.3 SPI3 SPI3全长约为17 kb，位于染色体82＇处的selCtRNA位点下游，含10个开放阅读框，组成6个转录单位，其中mgtCB操纵子编码高亲和力Mg2+传输蛋白质和MgtC，可介导沙门氏菌在巨噬细胞和低Mg2+环境中存活。

1.4 SPI4 SPI4全长约25 kb，位于染色体92＇处，含有18个开放阅读框(ORFs)，可能由1个操纵子组成。编码介导毒素分泌的Ⅰ型分泌系统，并参与调节沙门氏菌适应巨噬细胞内环境[10]，但其主要功能有待进一步研究。

1.5 SPI5 SPI5全长7 kb，位于沙门氏菌染色体25＇处，其两侧为serT和copS/copR位点，G+C含量约43.6%，包含sop、sig、pip共3个基因，负责编码参与肠粘膜液体分泌和炎症反应的相关蛋白，从而导致肠道液体的分泌和炎症反应，并且受SPI1和SPI2编码的蛋白所调控[11]。

1.6 SPI6 SPI6含有59个基因，首先在沙门氏菌亚种I中发现，其两侧分别为tRNAaspV基因和菌毛saf基因簇。实验表明删除鼠伤寒沙门氏菌整个SPI6对系统性发病机制没有影响，但却能使侵入人工培养细胞中的鼠伤寒沙门氏菌数量减少[12]。

1.7 SPI7 SPI7是伤寒沙门氏菌、都伯林沙门氏菌和甲型伤寒沙门氏菌的特有基因片段，长133 kb，毗邻tRNApheU基因。SPI7编码的重要毒力因子是Vi荚膜、SopE噬菌体和IVB菌毛。SPI7可能是通过水平转移获得，其基因组序列极为复杂。由于在SPI7中发现基因pil，tra和sam，因而SPI7被认为可能起源于接合质粒或接合转座子。Pickard的一项研究显示，SPI7中被称为PAGI3的部分也出现在包括植物病原体地毯草黄单胞菌致病变种和铜绿假单胞菌及其他几种细菌中[13]。Michael H对一株伤寒沙门氏菌分离株进行研究，并未观察到Vi荚膜表型，说明SPI7基因不稳定[14]。噬菌体SopE也出现在缺失SPI7的肠炎沙门氏菌亚种I分离珠，表明噬菌体SopE可以被激活，并转移sopE基因到其他分离株[15]。

1.8 SPI8 SPI8是在进一步研究肠炎沙门氏菌和伤寒沙门氏菌基因组序列时发现的。SPI8仅由6.8 kb组成，与tRNApheV基因相邻[16]。编码细菌素基因，但到目前为止没有关于其功能的报道。

1.9 SPI9 SPI9仅16 281 bp，是沙门氏菌中发现较小的毒力岛，位于伤寒沙门氏菌染色体中。SPI9编码I型分泌系统和大型RTX样蛋白，SPI9也出现在鼠伤寒沙门菌染色体中。

1.10 SPI10 SPI10大小为32.8 kb，位于tRNAleuX基因中，包含sefB、sefC和sefR基因，编码Sef菌毛及引导伴侣蛋白调控菌毛操纵子[17]。Sef菌毛仅存在于伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌中，因而SPI10被认为是确定宿主特异性的一个因素。但到目前为止关于SPI10的研究还较少。

2 沙门氏菌Ⅲ型分泌系统

目前认为革兰氏阴性致病菌在长期进化过程中形成入侵宿主细胞的特异性分泌系统共有5种类型(Ι～V型)，其中最显著的便是细菌T3SS。对许多革兰氏阴性致病菌来说T3SS是必不可少的，并且T3SS与鞭毛系统具有很高同源性，关于两者之间的关系有许多猜测及验证性报道，最近Vitold E G等研究发现沙门氏菌T3SS是从鞭毛系统演化而来的[18]。除沙门氏菌、大肠埃希氏菌、耶尔森菌、志贺氏菌等病原菌早已发现有T3SS外，近年研究发现铜绿假单胞菌、气单胞菌、致病弧菌也存在T3SS[19]。

沙门氏菌的T3SS主要由SPI1和SPI2基因编码产物组成，其功能主要表现在两方面：其一，引导沙门氏菌的分泌蛋白转运至宿主细胞并激活宿主细胞信号传导通道，从而刺激宿主细胞产生细胞因子诱导巨噬细胞凋亡；其二，促使在沙门氏菌表面装配侵袭小体。在沙门氏菌属中，绝大部分沙门氏菌均只有一套T3SS，仅鼠伤寒沙门氏菌特有2套完全独立的T3SS，可在感染的不同阶段发挥相应作用：第一套T3SS主要参与入侵真核细胞，第二套则有利于侵入真核细胞后鼠伤寒沙门氏菌的生存[20]。近年在沙门氏菌T3SS组成、T3SS分泌及调控机制、T3SS与沙门氏菌致病性等研究方面取得了巨大进展。

2.1 沙门氏菌T3SS组成

2.1.1 T3SS组成蛋白 T3SS是由多组分蛋白组成的一个复合蛋白通道，所有的T3SS蛋白从功能上分成四类：菌膜装置蛋白(Bacterial membrance apparatus proteins)、转位子蛋白(Translocon proteins)、效应蛋白(Effector proteins)、T3SS分子伴侣(Type chaperones)。菌膜装置蛋白横跨细胞内、外膜，并延伸形成一个针状结构(即注射装置)通向胞外[21]。

转位子蛋白在细菌细胞膜上形成一个小孔与注射装置的针头相对接方能使效应蛋白进入到宿主胞质中，缺少转位子蛋白，效应蛋白则无法进入宿主细胞。效应蛋白在细菌致病过程中起关键作用，可引起宿主相应的病理变化，如修饰宿主细胞肌动蛋白细胞支架功能使其能进入非吞噬细胞内或黏附在上皮细胞表面，诱导感染的巨噬细胞凋亡等。

2.1.2 T3SS注射装置 虽然各种细菌的T3SS在分泌功能上具有相似性，但在组织结构上却各不相同。电子显微镜观察显示，沙门氏菌T3SS的分泌装置是一个类似针头形状的超分子结构，现在通常将其称为T3SS注射装置[22]。T3SS注射装置可以帮助沙门氏菌定植在宿主细胞的胞膜上并将沙门氏菌分泌的效应蛋白注入宿主细胞，该注射过程需要跨过3层膜(2层沙门氏菌胞膜和1层宿主胞膜)[23]。沙门氏菌T3SS注射装置的核心是一个针头状的复合物：由一个圆柱形基座和一个针头状突起构成。基座是由分子量相同的3种蛋白组成的：InvG蛋白分泌家族的一部分组成底座的外环，PrgH/PrgK(具有脂蛋白的结构修饰单元)组成基座的内环[24]。T3SS由圆柱形基座固定在沙门氏菌表面，基座中贯穿有圆柱状的连接针头与基座的杆：杆状结构由杆部结构蛋白PrgJ构成；针状结构由针状PrgI蛋白和调节针状蛋白复合物装配的InvJ蛋白组成。基座不仅可以帮助蛋白穿过细菌的内膜和外膜，而且和周质中的分泌结构有密切联系。针头状突起是一个直的中空筒状结构，长约60 nm，其内部有专门输送分泌蛋白的狭窄中心孔道(约28Å，2～ 3 nm)，孔道从底部的环状结构一直延伸到针头的顶端[25]。中心孔道非常小，折叠的蛋白要经过伸展后才能从中通过。针头结构可以将细菌的效应蛋白直接注入宿主细胞。

2.1.3 T3SS分子伴侣 T3SS分泌蛋白，需要与细胞质中的附属蛋白特异结合，这种附属蛋白就称为分子伴侣。分子伴侣相对分子量低(<20 000)、等电点低、二级结构以螺旋为主、通常是酸性。沙门氏菌T3SS分子伴侣缺少ATP结合位点和ATP水解活性。大多数情况下分子伴侣与特定的分泌蛋白相结合，也有的分子伴侣可以与多个分泌蛋白结合。这些分子伴侣与分泌蛋白N端的下游50～ 100氨基酸结合，分子伴侣使分泌蛋白在分泌前迅速伸展便于通过T3SS。将分泌蛋白呈递给注射装置后分子伴侣自己仍然留在细菌胞质中。另外，T3SS分子伴侣可促进相应底物分泌。T3SS分子伴侣和参与鞭毛组装的分子伴侣很相似，过去认为T3SS分子伴侣从鞭毛伴侣进化而来，但现在有报道认为：它们拥有共同的祖先，但却是各自独立进化[26]。

目前在沙门氏菌T3SS发现的分子伴侣主要有：SicA、InvI、VnvH和OrgA。SicA可引导分泌蛋白进入转位机制或阻止蛋白在分泌前降解。InvI的基因与InvJ及SpaQ相毗邻，有人认为InvI可能是InvJ和SpaQ的分子伴侣。InvH具有使沙门氏菌粘附和侵入上皮细胞的能力，可能使沙门氏菌在内化前与宿主细胞发生黏附，起黏附素的作用。OrgA可能与沙门氏菌的入侵和蛋白分泌有关，同时参与对氧的调控。沙门氏菌分子伴侣在T3SS中发挥着重要作用，可与胞质中的效应分子结合，能将效应分子运输到分泌装置进行分泌，并对效应分子的构象形成有一定作用。T3SS分子伴侣结合相应的效应蛋白，保护相应的效应蛋白在胞质内不被降解，并有效地分泌、转移效应蛋白。分子伴侣还能够稳定细胞质内相应的底物，阻止相应底物与其他效应蛋白或转位子蛋白未成熟前的同种或异种蛋白的结合，这种结合可能会导致结合蛋白的降解[27]。

2.2 T3SS分泌及调控机制 T3SS通常在沙门氏菌与宿主细胞接触获得激活信号才能启动分泌。研究表明T3SS分泌信号位于沙门氏菌mRNA结构中，过去长期被认为是位于分泌蛋白的N端部分氨基酸。T3SS分泌蛋白时与分子伴侣结合是确保分泌前的稳定性和有效分泌的重要环节。沙门氏菌SPIl编码的T3SS可释放几种效应蛋白刺激宿主细胞的信号转导途径，导致一系列的细胞反应，如肌动蛋白的变构从而导致细胞骨架的重排、转录因子的激活、离子通道的刺激，在某些细胞甚至会使细胞凋亡[28]。

沙门氏菌T3SS分泌和转移过程是由非常复杂的转录机制和转录后机制调控的，此调控机制主要受到时间(生长阶段)和空间(宿主细胞内外)的限制。例如，T3SS须获得一个激活信号(来自于沙门氏菌mRNA结构)才能行使他的分泌功能。转录后调控机制是沙门氏菌在与宿主细胞相互接触后才发挥功能的。沙门氏菌入侵基因表达的调控是由转录水平的几个环境因素决定的，例如渗透压、氧浓度或生长阶段。目前，在分子水平仅发现DNA的超螺旋结构会影响蛋白的分泌；在蛋白水平，有两个蛋白InvF(属于转录激活子AraC家族)和HilA(属于转录激活子OmpR/ ToxR家族，HilA又调节OrRA、SipC和InvF，这几个蛋白最终形成一个调节茎环结构)参与沙门氏菌的入侵[29]。此外，沙门氏菌T3SS还受到几个调控网络的影响，如菌毛调控系统、PhoP/PhoQ调控系统[30]和OmpR/EnvZ调控系统及DNA结合蛋白HilD等。

2.3 T3SS与沙门氏菌致病性 沙门氏菌的致病性与其T3SS分泌的致病效应蛋白密切相关，在已知对动物致病的21种效应蛋白中，由沙门氏菌T3SS分泌的占到12种[31]。其中，沙门氏菌SPI1编码的T3SS分泌8种：AvrA、SipA、SipC、SopB、SopD、SopE、SspH1、SotP；沙门氏菌SPI2编码的T3SS分泌的4种：ExoS、ExoT、ExoV、ExoY；另外耶尔森氏菌占6种(YopA/O、YopE、YopH、YopJ/P、YopM、YopT)，志贺氏菌占2种(IpaA和IpaC)。用鸡所做的试验表明，由SPI2编码的T3SS与鸡沙门氏菌对鸡的毒力有关。同时研究表明，缺失T3SS的鼠伤寒沙门氏菌不论感染途径如何均不能引起全身性疾病。

3 应用研究

研究沙门氏菌毒力岛及其编码的T3SS对于了解沙门氏菌致病机制具有重要作用，因而现在越来越多的研究者对沙门氏菌毒力岛及其编码的T3SS表现出浓厚兴趣，沙门氏菌毒力岛及其编码的T3SS已成为沙门氏菌研究的热点之一。目前，在沙门氏菌中已鉴定出毒力岛12个，是否还存在尚未发现的毒力岛还有待进一步研究。王晶钰等研究表明携带SPI1+SPI2与沙门氏菌的致病性呈正相关，并且SPI3可作为检测沙门氏菌的毒力标志[32]。Taseen S D等通过评价肠炎沙门氏菌SPI1编码的毒力蛋白作为预防禽类的疫苗具有良好的效果，因此他们认为将沙门氏菌SPI1编码的蛋白与其它相关蛋白组合成亚单位疫苗来预防禽类肠炎沙门氏菌将具有广泛的研究及应用前景[33]。Amanda LS等将肠炎沙门氏菌SPI2编码的蛋白作为疫苗免疫试验鸡，通过测定发现鸡卵黄IgG和血清IgG抗体水平明显上升，表明将肠炎沙门氏菌SPI2编码的蛋白作为疫苗免疫鸡可以显著提高鸡体液免疫水平的作用[34]。因而，预计今后关于沙门氏菌SPI1及SPI2编码的蛋白作为预防沙门氏菌的疫苗抗原的研究将会成为一个研究热点。

近几年来对于沙门氏菌T3SS在抗肿瘤方面的研究也取得了一定进展。Pawelek等[35]通过基因缺失突变实验证明，鼠伤寒沙门氏菌SPI2编码的Ⅲ型分泌系统对于沙门氏菌抗肿瘤效应至关重要，可使得沙门氏菌靶向至肿瘤并在瘤内增殖。敲除SPI1体外实验发现可降低沙门氏菌的侵袭力100倍，但是体内实验证明对于肿瘤生长却并无抑制作用；然而，敲除SPI2即可消除肿瘤生长抑制现象。HiroyoshiNishlkawa等[36]通过构建鼠伤寒沙门氏菌疫苗株进行肿瘤消除实验发现沙门氏菌T3SS可使肿瘤生长速度减慢，然后逐渐变小甚至消失，因而他们认为沙门氏菌T3SS产生的抗原在肿瘤疫苗方面很有研究前景。Klaus Panthel等[37]通过研究沙门氏菌T3SS的抗小鼠纤维瘤免疫力，得出相似结果。最新研究显示减毒沙门氏菌通过T3SS可介导与宿主之间的反应，能传递效应基因并在细胞表面或胞浆中表达多种治疗性蛋白，诱导机体产生相应的特异性体液免疫、细胞免疫及局部黏膜免疫反应，抵抗携带相应外源蛋白的病原体入侵。尽管减毒沙门氏菌在肿瘤基因治疗上具有良好的基因传递载体优势，但肿瘤基因治疗目前还处于发展早期，在临床应用中还存在许多困难：如何提高沙门氏菌作为兼性厌氧菌对乏氧组织的靶向定植特异性；如何减轻甚至消除沙门氏菌作为致病菌其内毒素及T3SS分泌的致病性效应蛋白可能存在引起机体部分机能甚至全身性疾病的潜在危害；如何将减毒沙门氏菌载体高效地转移至机体肿瘤组织内部甚至进入处于静止期的肿瘤细胞；如何提高减毒沙门氏菌T3SS分泌蛋白表达效率及能否将肿瘤基因治疗与其他常规肿瘤治疗方法联合应用等，都是减毒沙门氏菌T3SS在肿瘤基因治疗中存在的科学难题。即使面临这些难题，肿瘤的基因治疗在现代临床医学中仍拥有广阔的发展前景，只要努力解决好存在的各种问题，今后减毒沙门氏菌必将在肿瘤的治疗中发挥非常重要的作用。

对沙门氏菌毒力岛及其编码的T3SS的研究，有助于阐明沙门氏菌分子水平致病机制，对于发展肿瘤基因治疗、开发肿瘤基因治疗疫苗及研发抗革兰氏阴性菌药物具有重要意义。

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Salmonella pathogenicity island and type III secretion system

CHEN Jun1,JIANG Wen-can1,2,TAN Tian1,XU Kai-di1,YANG Li-hong1

(1.Animal Medicine College, Sichuan Agricultural University, Ya'an 625014, China;2.Sichuan Key Laboratory of Animal Disease and Human Health, Ya'an 625014, China)

Salmonellawas a gram-negative bacterium which parasitized in the intestinal of humans and animals, which could cause a variety of different clinical symptoms in human and animals, and being one of the main pathogens for human food toxicosis. The invasiveness ofSalmonellawas directly related to pathogenicity island (PI) and type Ⅲ secretion system (T3SS) encoded by PI. The research progress ofSalmonellapathogenicity island, the composing of T3SS, secretion and regulation mechanisms of T3SS, T3SS and salmonella pathogenicity, and application research was summarized in this paper, and with a view to providing reference for in-depth study.

Salmonella; pathogenicity island; type III secretion system; T3SS

Jiang Wen-can, Email: jiangwc1234@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.017

蒋文灿，Email：jiangwc1234@163.com

1.四川农业大学动物医学院，雅安 625014； 2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，雅安 625014

S855.1

A

1002-2694(2015)04-0371-06

2014-07-10；

2015-02-15

教育部长江学者和创新团队发展计划创新团队项目(IRT0848)

Supported by the Program for Changjing Scholars and Innovative Research Team in University (No. IRT0848)