徐武杰,汪 雁,邹节新,3 ,朱春潮,3,周宪民,3

DNA条形码及其在寄生虫学中的应用

徐武杰1,汪 雁2,3,邹节新1,3,朱春潮1,3,周宪民1,3

寄生虫作为与人类健康密切相关的特定生物类群，其分类是寄生虫学研究的重要基础。DNA条形码(DNA barcoding)即通过使用一段标准DNA片段进行快速、准确的物种鉴定。它是继RFLP、PCR-RFLP、SSR-PCR、ISSR等之后，在计算机及互联网得到广泛应用基础上，新发展起来的一项分子标记技术。因其具有在动物分类中可克服表型可塑性(Phenotypic plasticity)和遗传可变性(Genetic variability)的影响，以及不受性别和发育阶段限制等突出特点，而成为当前分类学研究的热点。本文阐述了DNA条形码的概念形成及发展、基本方法及尚存在的部分争议，介绍了该技术在寄生虫学原虫、蠕虫和节肢动物分类鉴定中的应用概况，同时对DNA条形码相关技术的发展以及在寄生虫学研究中的应用前景进行了展望。

DNA条形码；寄生虫；分类

寄生虫分类的基础源于卡尔·林奈(Carolus Linnaeus，1707- 1778)1735年在其著作《自然系统》(Systema Naturae)提出的“双名法”，并在达尔文的共同祖先原则上逐步建立起来的生物分类体系。寄生虫的分类通常采用以形态学为基础，结合宿主、生活史与地理分布等方面特点的经典分类法，但随着现代生物学的发展，人类对物种的定义、分类及其系统发育问题认识的不断深入，经典分类法本身所固有的一些局限性也逐渐显露出来，其中突出的表现为物种的表型可塑性(Phenotypic plasticity)和遗传可变性(Genetic variability)对准确分类的影响[1]。此外，物种的多样性、个体完整性、发育阶段限制性及对鉴定专家的依赖性均严重制约了经典分类法在寄生虫学研究中的应用。随着分子生物学、分子系统学的发展，RFLP、PCR-RFLP、SSR-PCR、ISSR、SNP等一系列分子遗传标记技术已应用于物种分类鉴定中，但由于没有形成统一的分子钟及关于属种等分类阶元之间遗传距离或遗传差异的普遍标准，极大限制了这些分子遗传标记技术在物种鉴定及系统发生分析中的广泛应用。当前依托互联网数据交流的便利性，以原有的分子遗传标记技术为基础，产生的DNA条形码(DNA barcoding)技术，已逐渐成为DNA分类学的研究热点。

1 DNA条形码的概念形成及发展

DNA 条形码(DNA barcoding)是指一段较短的、能够高效鉴定物种的DNA标准序列[1]。DNA barcoding技术是指对一个标准化、较短的DNA序列片段的变异进行分析的一种分子分类技术，具有原理简单、操作便捷、准确率高、可重复性强、利于标准化等优点，是物种鉴定、发现隐存种和研究生物遗传多样性、生物系统进化、分类和生物保护等的有力工具[2-3]。

Paul Hebert等[1]于2003年对脊椎动物和无脊椎动物共11门13 320个物种的线粒体细胞色素C氧化酶亚基基因(COⅠ)序列比较分析，发现除腔肠动物外，98%的物种的平均遗传距离在种内为0% ～2%，种间差异则可达到11.3%，受商品条形码技术(Barcode techniques)的启发，据此提出可以用单一的小片段基因作为物种的DNA条形码(DNA Barcoding)为全球生物编码。2003年3月和9月在美国冷泉港分别召开题为“Taxonomy and DNA”和“Taxonomy, DNA and the Barcode of Life”会议，会议系统地提出基于DNA序列片段鉴定生物物种的标准及其实施框架，正式发起了国际生命条形码计划(International Barcode of Life, iBOL, http: //www. barcodeoflife. org)[2]。2004年华盛顿Smithsonian国家自然历史博物馆成立生命条形码联盟(consortium for the barcode of life, CBOL, http: //moc. barcodeoflife. net/)， 成立了专门组织以发展DNA条形码鉴定生物物种的全球标准。随后，在2005年至2011年先后召开了四次国际DNA条形码会议，极大推进DNA条形码研究在全球范围展开。2013年10月，iBOL中国委员会承办的“第五届国际生命条形码大会”在中国云南举行，会议围绕“全球变化下的生命条形码：挑战与机遇”主题，就DNA条形码研究的最新进展成果进行了深入探讨和交流，并发布《昆明宣言》呼吁加强全球范围在生命条形码领域的进一步合作(http: //www.cas.cn/hy/xshd/201311/t20131104_3967353.shtml)。截止2014年8月22日，国际生命条形码计划收录样本4 463 670份，涵盖动物、植物、真菌和原生生物，尤以节肢动物门(3 329 106)、脊索动物门(417 094)和被子植物门(275 030)样本居多。其中条形码样本3 309 531份，包含213 059种物种(http: //www. barcodinglife. org)。

在国内，早在2008年初中国科学院即与iBOL共同签订合作备忘录，并成立了由中国科学院和高等院校组成的iBOL中国委员会，2010年，在iBOL中国委员会的推动下，以国家自然科学基金委员会重大项目形式，选择了部分重要生物类群(两栖爬行动物、鱼类、榕小蜂)开展DNA条形码研究[4]。此外，国内学者对其他生物类群如：韩建萍等对中药材；刘沐桑等对8种病原真菌；马明义等对32种鸟类等等多种生物类群的DNA条形码进行了研究与尝试[5-7]。我们在中国知网(http: //epub. cnki. net)以“DNA条形码”为关键词，对2009到2013年五年间发表的相关文献进行搜索，结果文献数量分别103、161、229、338、426篇；在科学基金共享服务网(http: //npd. nsfc. gov. cn)以“DNA条形码”为项目主题词，搜索2009至2013年度近五年批准资助国家自然科学基金项目数量分别为219、308、371、391、402项。上述数据表明，DNA条形码研究已成为生命科学领域的研究热点，但截止2014年8月22日，搜索BOLD数据库(http: //www. barcodinglife. org)仅发现4条淡水蟹类DNA条形码标准基因数据，因此亟待开展相关研究。

2 DNA条形码研究的基本内容

DNA条形码研究大致由3部分内容组成：样品收集部分，包括动物标本的采集、相关采集数据的整理并由此评价选择实验标本样品规模等；分子实验部分，包括DNA提取、引物设计与合成、PCR扩增、测序等；数据分析部分，包括序列拼接与校对、处理与分析以及最终实现物种鉴定[8]。

研究方法中样品收集与分子实验部分均有非常多的经验可供参照，但在数据分析方面针对不同的生物类群相关的争论及讨论较多。如对绝大多数动物DNA条形码标准序列采用遗传距离法分析时，一般都采用K-2-P遗传距离(或联合使用K-2-P遗传距离和P遗传距离)，分别计算不同分类阶元(种、属)的遗传距离并统计出最大值、最小值和平均值，然后绘制遗传距离分布直方图，根据种、属间的遗传距离分布规律推算出DNA条形码间隙(barcoding gap)阈值[9]。Hebert等[10]根据鸟类的DNA条形码研究提出barcoding gap的“10×规则”，即种间的平均遗传距离约为种内的10倍。进化树分析也是DNA条形码数据分析的基本方法，常用的有NJ树、BI树、ML树和MP树等，其基本原理是根据所建进化树的聚类关系确定样品的物种： 同种个体往往聚为一支，而不同种个体则形成不同的集合[11]。但需要注意的是所建进化树反映的仅仅是样本个体间的聚类，而非各物种间的系统发生关系的全面反映。BLAST、BLAT、FASTA等相似性分析方法也常常用于DNA条形码数据分析，其中BLAST比对法最为普遍，其采用局部比对或者近乎精确的短字符串匹配算法，评估查询序列与参考序列的数据相似度，鉴定标准是查询序列与参考物种目标序列相似度至少高于80%[12]。此外，近年来采用CAOS(Characteristic Attribute Organization System)、BLOG(Barcoding with LOGic Formulas)等基于诊断法的分析，以及回归树法CART(Classification And Regression Trees)、随机森林法RF(Random Forest)等统计分类法分析也逐渐应用于DNA条形码研究[13-14]。

总之，各种DNA条形码分析方法各有其特点，在各类生物数据库GenBank(http//www．ncbi．nlm．nih．gov/genbank)、BOLD(http: //www. barcodelife. org)、ABBI(All Birds Barcoding Initiative, http: //www. barcodingbirds. org/)、FISH-BOL(Fish Barcod of Life, http: //www. fishbol.org/)、All Leps(http: //www. lepbarcoding. org/)、TBI(Tephritid Barcode Initiative)、MBI(Mosquito Barcode Initiative)中，至今并未存在一种完全通用于所有物种的单一分析方法及软件。分类数据急剧增长的背景下，DNA条形码分析方法正向多样化和整合分析的方向发展，其中生物信息学方法将起到愈来愈重要的作用[8]。

3 DNA条形码存在的争议

自Hebert提出“DNA条形码”概念以来，得到了许多生物学家的支持并在相关研究中取得较大进展，条形码技术已发展成为一种公认的快速高效生物物种鉴定的方法。但与此同时自身存在的若干问题在业内也多有不同意见，当前对DNA条形码的争议主要集中在以下几个方面：

3．1 有研究证据表明标准条形码的选择有可能造成部分生物多样性的忽视 如对真核微生物的研究表明：标准条形码序列的选取存在广泛性和精确性的矛盾：若选取容易在所有种群扩增的基因片段，则该片段需具备高度的保守性，则会造成种群真实数量的低估；若选取更精确的描述种群数量的基因片段，则很难在所有种群中扩增[15]。而实际上，参考数据库中每个物种的代表样本包含的是物种所有群体多样性的主要组成部分[2]，因此，DNA条形码往往在鉴定复杂且近期分化的种群上失败，可能忽视了该种群的部分生物多样性[16]。

3．2 条形码间隙的争议 “Barcoding Gap”，作为条形码技术的关键问题，是指选择的标记序列在种内和种间变异的范围和距离[17]。若达到序列差异的标准阈值(即种间遗传距离超过种内遗传距离的十倍，二者存在明显的间隙。)基本可以将未鉴定的个体准确确定到它所在种的水平[10]。但实际上，这种方法可能出现假阳性和假阴性的错误[18]：一个种的远缘种群若长期与同种或不同种的生物种群之间产生基因交流，就可能产生假阳性结果；反之，若不同生物学物种之间序列差异相对较小，则出现假阴性结果。此外，Rudolf Meier等通过量化12459种后生动物的43 137条基因库序列种间距离，认为条形码间隙应使用最小种间间距，而不是被错误放大的平均种间间距[19]。

3．3 线粒体遗传的固有风险 由于线粒体DNA是母系遗传，其多样性与母代的遗传结构密切相关，使用线粒体基因位点存在高估样本分化的可能性，导致种群的结论不准确[2]。再者，物种的线粒体遗传会被其细胞内感染的共生生物的影响。如果种群被一种或多种共生生物感染，其线粒体多态性因这些共生生物通过自然选择而改变，因此线粒体DNA不能单独适用于历史密切相关或近期分化的物种[20]。此外，Benoit Nabholz等[21]通过对物种及其生活史特性、分类，分析线粒体的多样性，表明线粒体多样性本质上很难预测，不能完全准确反映物种的多样性。

起初提出DNA条形码概念，生物学家是希望能找到一个基因或者一段DNA序列就可以区别地球上所有的物种。但实际上，同一DNA条形码片段在不同类群中的使用效果不同，目前尚未获得统一的DNA条形码作为标准片段，如植物更适合选择mat K和 rbc L，而真菌多选择核基因的ITS[22]。因此，对可能的DNA条形码片段进行选择和评价在当前依然有研究的必要。但是，COⅠ基因片段已证明适用于大部分动物物种鉴定[23]。

4 DNA条形码技术在动物分类及寄生虫学中的应用概况

4．1 用于原虫的分类鉴定 原虫为单细胞真核动物，属于原生动物界。迄今为止，DNA条形码已运用于叶足虫、鞭毛虫、孢子虫、纤毛虫等原虫的种属鉴定中[24-26]。

Ttypanosome(锥虫)是寄生在鱼类、哺乳类以及人血液、组织、细胞内的鞭毛虫。由于Ttypanosome部分种类在形态学上难以区分，致病性上却相差很大，因此准确鉴定Ttypanosome的种类相当必要。Noyes等[27]总结以往的资料，推测澳洲袋鼠携带的trypanosomes与Ttypanosomalewisi(一种世界广布的鼠类锥虫)相关。而Patrick B．Hamilton等[25]运用DNA条形码数据，基于18S rRNA基因和磷酸甘油醛脱氢酶基因(gGAPDH)的系统发育树，证实澳洲袋鼠携带的trypanosomes与T．cruzi(克氏锥虫)的关系更为密切，而不是T．lewisi。

Eimeriatenella隶属于球虫目(coccidian)艾美耳属(Eimeris)，是单细胞寄生性原虫，可引起严重危害养禽业发展的鸡球虫病，遍及世界各地。准确鉴定艾美耳球虫，了解其细胞和分子生物学特性，对防治鸡球虫病有及其重要的意义。Joseph D．Ogedengbe等[26]通过对其实验室艾美球虫属样本进行基于COⅠ序列的系统发育分析，证实COⅠ可作为球虫目(coccidian)艾美耳属(Eimeris)物种鉴定很好的标记物，成为球虫亚纲合适的DNA条形码靶位。同时可与18S rDNA序列的联合运用，使用系统发生数据协助区分coccidian(球虫亚纲)至Apicomplexa(顶复亚门)中并系类群。

4．2 用于蠕虫的分类鉴定 蠕虫为多细胞无脊椎动物，因借肌肉的收缩而作蠕动状运动。在吸虫、绦虫、线虫等虫种鉴定中均有DNA条形码的运用[28-30]。

不同的血吸虫种株对中间宿主、终宿主的相容性，致病以及药物的敏感性等方面均存在差异，故血吸虫种株的分类研究对其流行病学研究、疾病的控制等方面均具有重要意义。Scott P.Lawton等[28]对Hungary(匈牙利)采集的10条Schistosomaturkestanicum雄性成虫DNA提取和PCR扩增，DNA序列比对和系统发育重建，细胞色素氧化酶1(COⅠ)和核核糖体内部转录区(ITS)比对，结果显示S．turkestanicum与亚洲血吸虫株具有明显差异，属于匈牙利特有株。

Echinococcus(棘球绦虫)是一种全球分布的寄生虫，可引起一种严重的人兽共患病——包虫病(Echinococcosis)。张高天等[29]通过对细粒棘球绦虫(E.granulosus)、多房棘球绦虫(E.multilocularis)和石渠棘球绦虫(E．shiquicus)DNA提取，目的片段的扩增，产物检测纯化扩增，遗传距离的计算和系统发育树的构建，结果显示平均种间遗离是种内遗传距离的12到18倍，证明了DNA条形码技术是棘球绦虫种属鉴别行之有效的技术。

Filaria(丝虫)是由节肢动物传播的一类寄生虫线虫。不同丝虫种群的传播媒介、致病性等均有所不同。Emanuele Ferri等[30]通过比较传统形态学方法和DNA条型码技术在区分丝虫种类上适用性和有效性，用不同参数比较形态学鉴定和分子鉴定的相关性，证明使用COⅠ和一定水平的核苷酸的差异可以划分种群范围，此外DNA条型码技术也可以用来推断潜在的的隐存种。

Trichuristrichiura(毛首鞭形线虫)简称鞭虫，为人体和动物肠道常见的寄生线虫。诊断鞭虫感染依靠其特征性虫卵——呈纺锤形且两端各有一透明塞状突起。随着生物种群的不断进化和发展，尤其对那些相似种或近缘种，寄生虫的形态学鉴定越来越显出它的局限性，如鞭虫的形态会受宿主种类的影响。Lisa Guardone 等[31]鉴于不同种的鞭虫卵形态相似，形态学诊断难以达到种的水平，通过鞭虫成虫和卵DNA的提取、PCR、测序和数据分析，证明COⅠ基因位点的种间差异很大，可作为合适的DNA条形码，在分辨近缘物种上具有重要价值。

4．3 用于节肢动物的分类鉴定 节肢动物门是动物界中最大的一门，分布广泛，占动物种类2/3以上。昆虫纲、蛛形纲、甲壳纲中序列测定的成功运用，证明了DNA条形码在节肢动物鉴定中的有效性及重要性[32-34]。

蚊隶属于双翅目、蚊科，是疟疾、丝虫病和流行性乙型脑炎等多种疾病的传播媒介。蚊的外部形态鉴定相对困难，尤其是作为疾病监测指标的野外采集样本。面对这个难题，王刚等[32]通过对中国八个省份的已使用形态方法鉴定的三个亚科15属122种或亚种的蚊样本分析检测，进行了样本COⅠ序列分析和NJ树分析，首次提供了中国蚊子的COⅠ条形码，进一步证实了DNA条形码鉴定物种的有效性。

叶螨类隶属于蜱螨亚纲叶螨科，是农作物、林木和花卉等的重要有害植物寄生虫。为了了解和推断叶螨的进化过程和生态多样性，准确的进行种的划分和识别极为重要。鉴于叶瞒科物种有限的形态学特征，且这些特征具有高度的相似性，传统形态鉴定相对困难，李国庆等[33]通过叶螨DNA提取、扩增、测序及相关分析，探讨了基于线粒体COⅠ作为分子条形码解决中国叶满科物种鉴定以及系统发育问题的可行性，结果显示种间差异大于种内差异，属间差异大于种间差异，证实COⅠ基因序列可以用于叶瞒物种的系统发育分析。

甲壳纲作为节肢动物最多样化的群体之一，其中部分类群是寄生虫的中间宿主或终宿主。鉴于传统形态学分类上的不足，Filipe O. Costa等[34]通过对150份来自不同种的甲壳动物样本进行DNA提取、扩增、测序以及数据分析，结果显示种间核苷酸序列差异是种内个体间差异的19到48倍，证明COⅠ条形码区域的序列变异对鉴别甲壳动物种类非常有效，条形码技术适用于甲壳动物的分类鉴定。

此外，Martha Betson等[35]使用DNA条码技术和微卫星DNA对Unguja Zanzibar蛔虫进行分子流行病学调查，Jorge Azpurua等[36]通过使用DNA测序技术来确定巴拿马 Barro Colorado Island白蛉的生物多样性以及可能的系统发生。DNA条形码技术在寄生虫学中的应用已不仅仅局限于虫种的分类鉴定，它已渗透到寄生虫学相关的各个方面。

5 展 望

伴随各类DNA条形码数据库的建立及技术的进步，尤其是第二代测序(next-generation sequencing, NGS)技术的出现，产生了利用高通量测序技术获得条形码基因扩增子序列的方法，即对混合样本扩增DNA条形码序列后进行高通量测序，在对高通量测序数据集的后续生物信息学分析中引入分子操作分类单元(molecular operational taxonomic units: MOTU)， 从混合样品中自动识别出多个物种，称为DNA metabarcoding 技术，目前该技术已用于微生物和动物的相关研究中[37,38]。DNA metabarcoding技术为寄生虫及宿主的同步研究提供了一个前所未有的便捷工具。并且，应用PCR-free metabarcoding技术可评估混合样品中每个物种线粒体DNA的数量[38]，这为病原学调查提供了一种检测病原体感染度的新方法。

此外，微型条形码(DNA minibarcoding)，是指利用长度仅为100-200 bp的部分标准条形码基因序列进行鉴定物种。微型条形码技术的发展，对博物馆、标本馆等保存的陈旧样本利用具重大意义。国际上，Lee 等[39]从已有75年历史的标本中扩增出微型条形码研究印度喜马拉雅山脉小翅蛾的分类地位，在国内程鹏等[40]将DNA微型条形码应用于53个鱼类样品中证明其具有高准确性。

目前，我国的DNA条形码研究正通过国家自然科学基金重大项目及国家科技支撑计划项目[4]等形式，逐步以统一体系、规范领导的模式加入到国际生命条形码计划中，成为全球性研究的一个重要组成部分，但另一方面，对诸如寄生虫等病原生物或医学媒介生物等独特生物类群的DNA条形码研究，依然呈零散研究为主态势，缺乏系统性的引导，亟待在国家层面有重点、有系统地推进病原生物DNA条形码研究。

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DNA barcoding and its applications in parasitology

XU Wu-jie1,WANG Yan2,3,ZOU Jie-xin1,3,ZHU Chun-chao1,3,ZHOU Xian-min1,3

(1.Department of Parasitology, Medical College, Nanchang University, Nanchang 330006, China;2.Medical Genetics and Cell Biology Laboratory, Medical College, Nanchang University, Nanchang 330006, China; 3.Key Laboratory of Poyang Lake Environment and Resource Utilization Supported by the Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Parasite is a specific organism group closely related to human health, and its taxonomy and classification are important foundation for parasitological research. "DNA barcoding" is a rapid and accurate method for species identification through a standard DNA fragment. It is a new developed molecular marker technology after RFLP, PCR-RFLP, SSR-PCR, ISSR etc., based on the powerful computers and widely using internet. As it overcomes the negative influence of phenotypic plasticity and genetic variability, and is not restricted by gender and development stage, it has become the current hot spot in taxonomical study. In this paper, we reviewed the evolution of DNA barcode concept and technology, basic methodology, and current controversy, and described it's application in identification of protozoa, helminth and Arthropoda, the development of DNA barcode technology, and its application in parasite research.

DNA barcoding; parasite; classification

Zhou Xian-min, Email: zhouxmjxmu@126.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.016

国家自然科学基金项目(No. 81260257，81160207，31460156)，江西省自然科学基金(No. 20132BAB205059)，江西省医学科研项目(No. 20122025)，江西省教育厅项目(No. GJJ12084)联合资助

周宪民，Email：zhouxmjxmu@126.com

1.南昌大学医学院寄生虫学教研室，南昌 330006； 2.南昌大学医学院医学遗传与细胞生物学实验室，南昌 330006； 3.南昌大学鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室，南昌 330047

R38

A

1002-2694(2015)04-0365-06

2014-06-28；

2014-10-24

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81260257, 81160207, and 31460156), the Natural Science Foundation of Jiangxi Province of China (No. 20132BAB205059), the Medical Scientific Research Foundation of Jiangxi Province of China (No. 20122025), and the Educational Department of Jiangxi Province of China (No. GJJ12084)