刘 艳，刘 丹，朱翠明

肺炎支原体LAMPs经PI3K/Nrf2诱导人单核细胞表达HO-1

刘 艳1，刘 丹2，朱翠明3

目的 探讨肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，Mp)脂质相关膜蛋白(lipid-associated membrane protein，LAMPs)对人单核细胞表达血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的影响，并探讨可能的调控机制。方法 体外培养THP-1细胞，用不同浓度的LAMPs作用后，分别采用realtime-PCR和Western blot检测HO-1 mRNA和蛋白的表达。同时采用不同浓度的放线菌素D(ActD)和放线菌酮(CHX)预处理细胞，观察其对HO-1表达的影响，以证实HO-1的表达是否通过转录和翻译水平；提取LAMPs作用前后的核蛋白，凝胶迁移率实验检测Nrf2的核转位、Western blot检测Akt的磷酸化情况；同时采用PI3K抑制剂LY294002处理细胞，观察其对LAMPs诱导Nrf2核转位及HO-1表达的影响；最后采用 siRNA干扰Nrf2表达，以证实Nrf2是否参与调控HO-1表达。结果 (1)0～5 μg/mL LAMPs能以剂量依赖性方式诱导THP-1表达HO-1 mRNA和蛋白；(2)5 μg/mL LAMPs能诱导THP-1细胞Akt磷酸化，并能增强其DNA结合活性；PI3K抑制剂LY294002处理后，可明显抑制LAMPs诱导的HO-1表达和Nrf2核转位；(3)干扰Nrf2表达后，可明显下调LAMPs诱导THP-1细胞表达HO-1。结论 LAMPs可诱导THP-1细胞表达HO-1，其机制可能与PI3K/Nrf2通路有关。

脂质相关膜蛋白；血红素氧合酶-1；核因子相关因子-2

肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，Mp)是引起非典型肺炎最常见的病原体之一[1]。目前，对支原体的发病机制尚未明了。有研究显示，支原体细胞膜上的脂质相关膜蛋白(lipid-associated membrane proteins，LAMPs)是其诱发免疫反应的主要物质[2-3]。LAMPs刺激机体产生细胞因子、活性氧类(ROS)、NO等炎症产物[4]，一方面有利于免疫系统清除支原体，另一方面，过度炎症可能造成机体的免疫损伤[5]。为了维持机体内环境的稳定，必然存在多种炎症反应的负调控机制，能在炎症发生的各个阶段调控其反应的程度和强度，最终维持机体的免疫平衡。研究发现， 机体在感染状态下可合成多种保护性蛋白，包括血红素氧化酶-1(Heme oxygenase 1，HO-1)和还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶(NADPH：quinine oxidoreductase，NQO1)等。前期研究中，本研究所马小华等发现了支原体脂肽MALP-2可通过激活Nrf2诱导HO-1表达[6]。但由于MALP-2为人工合成脂肽，无法全面反应支原体感染的实际情况。本研究旨在观察LAMPs诱导人单核细胞表达HO-1的情况，并探讨其可能的调控机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 Mp标准株(ATCC 29342)由南华大学病原生物研究所保存；人单核细胞系THP-1购自中国典型培养物保存中心。Trizol试剂购自大连宝生物生工生物公司，BCA 蛋白测定试剂盒及ECL发光液体购自Pierce，LDH分析试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所，LY294002购自Sigma-Adrich，Lipofectamine 2000购自Invitrogen，Nrf2、HO-1 siRNA购自广州Ribio公司，抗HO-1、抗β-actin和TBP多克隆抗体购自Santa Cruz，抗Nrf2、抗磷酸化Akt和Total Akt抗体购自Cell Signaling。

1.2 方法

1.2.1 THP-1细胞的培养与预处理 将冷冻保存的THP-1细胞复苏并进行传代，选择处于指数生长期、且状态好的细胞分4组分别进行预处理。第1 组：将1×106/mL的THP-1细胞在无血清RPMI-1640培养基中37 ℃，5% CO2培养24 h；第2组：分别用不同浓度的放线菌素D(ActD，转录抑制剂)和放线菌酮(CHX，翻译水平抑制剂)预处理THP-1细胞1 h；第3组：用不同浓度的PI3K抑制剂LY294002预处理THP-1细胞30 min；第4组：对THP-1细胞不做任何预处理。

1.2.2 LAMPs的提取 将M129标准株菌液接种于PPLO肉汤培养基中37 ℃恒温孵育，5～7 d后，待培养基颜色由红色变为透亮的橙黄色后转接进行增量培养，收菌。LAMPs的提取按照相关参考文献进行[7]。

1.2.3 LAMPs最大作用浓度的选择 THP-1细胞经LAMPs作用前，首先采用LDH漏出实验确定其最大作用浓度。 将约105个THP-1细胞接种到96孔板中，加入不同浓度的LAMPs孵育24 h，通过检测各孔OD值/空白对照孔OD值以判断培养液中LDH的释放水平。

1.2.4 Western Blot检测 HO-1蛋白表达和Akt磷酸化 用不同浓度的LAMPs作用于第1组预处理THP-1细胞16 h，观察不同浓度LAMPs对HO-1蛋白表达的影响；用最大浓度LAMPs作用于第2组预处理的THP-1细胞16 h，观察放线菌素D和放线菌酮对THP-1细胞HO-1表达的影响；用最大浓度LAMPs作用于第3组预处理的THP-1细胞16 h，同时用最大作用浓度LAMPs作用第4组THP-1细胞0～60 min后，收集不同时间细胞总蛋白，用Akt磷酸化抗体和总抗体行Western blot，观察LAMPs对THP-1细胞Akt磷酸化的影响。

1.2.5 RT-PCR检测HO-1mRNA的表达水平 用不同浓度LAMPs作用THP-1细胞16 h和用最大作用浓度LAMPs作用THP-1细胞0～24 h，随后采用TRIzol法提取处理后THP-1细胞的总RNA，用RT-PCR检测HO-1mRNA的表达水平，观察LAMPs对THP-1细胞表达HO-1 mRNA在不同的作用浓度和不同的作用时间上的影响。

1.2.6 凝胶迁移率实验检测 Nrf2 DNA 结合活性 对THP-1 细胞进行预处理后，按照试剂盒提供的方法获取核蛋白、建立反应体系， 然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移后，交联固定 DNA， 化学发光显影。

1.2.7 siRNA转染实验 将THP-1细胞接种于培养板中。按lipofectamine 2000提供的操作步骤，将100 nmol/L Nrf2 siRNA(正义链 5′-UCCCGUUUGUAGAUGACAA-3′；反义链 5′-UUGUCAUCUACAAACGGGA-3′)加入细胞培养板中，转染4h后再换成完全培养基继续培养，30 h后，再用5.0 μg/mL LAMPs刺激THP-1细胞16 h，提取总蛋白，Western blot检测HO-1表达。

2 结 果

2.1 确定LAMPs的最大作用浓度 THP-1细胞经LAMPs作用前，首先采用LDH漏出实验确定其最大作用浓度。如图1所示，0.5～5 μg/mL LAMPs作用于THP-1细胞后，与对照组相比，LDH含量无统计学差异。而LAMPs浓度增加至10 μg/mL时，LDH含量明显增高。因此在随后研究当中，LAMPs采用最大浓度5 μg/mL作为刺激浓度。

2.2 LAMPs诱导THP-1细胞HO-1 mRNA表达RT-PCR结果显示，阴性对照组HO-1 mRNA表达水平极低，随着LAMPs浓度的增加，HO-1 mRNA含量逐渐增多(图2A)。此外，HO-1 mRNA水平在不同的时间点也有所不同，其中LAMPs作用8 h后达到峰值，随后逐渐下降(图2B)。

Fig.1 Effect of the release of LDH by different concentration of LAMPs

2.3 LAMPs诱导THP-1细胞表达HO-1 蛋白 Western blot显示，不同浓度LAMPs作用THP-1细胞16 h后，可明显诱导HO-1蛋白表达，其含量与LAMPs的浓度呈一定的剂量依赖性(图3)。

Fig.3 Impact on the expression of HO-1 protein by different concentration of LAMPs

2.4 LAMPs经持续的转录和翻译诱导HO-1表达 THP-1细胞经不同浓度的放线菌素(ActD，转录抑制剂)和放线菌酮(CHX，翻译水平抑制剂)作用后，可显著抑制LAMPs诱导THP-1细胞表达HO-1(图4A、B)。

2.5 LAMPs诱导THP-1细胞表达与PI3K有关 LAMPs作用15min后Akt磷酸化到达高峰，随后随之降低。而总Akt在所有处理组中保持恒定(图5A)。此外，采用PI3K抑制剂LY294002预处理THP-1细胞后，可显著降低LAMPs诱导HO-1的表达(图5B)。

2.6 LAMPs增强THP-1细胞Nrf2 DNA结合活性 LAMPs处理30 min尚不能检测出Nrf2 DNA结合活性的变化，60 min后开始增强，120 min后达到高峰。未标记Nrf2探针可使DNA-蛋白结合形成的滞后条带消失，而NF-κB探针对其无明显影响。此外，采用PI3K抑制剂LY294002处理后，Nrf2 DNA结合活性显著降低。见图6。

2.7 干扰Nrf2表达抑制LAMPs诱导THP-1细胞表达HO-1 采用siRNA干扰Nrf2表达后，再用LAMPs刺激THP-1细胞16 h，Western blot结果显示，HO-1的表达显著降低(图7)。

Fig.6 LAMPs could raise the DNA-binding activity of Nrf2 via PI3K pathways

3 讨 论

机体感染支原体后，单核巨噬细胞通过其表面的TLR识别，并经MyD88/TRAF6/NF-κB信号通路诱导合成和分泌一系列炎症因子和介质。对于机体而言，这些炎症因子的合成和分泌受到严格的调控，从而使机体的炎症-抗炎反应趋于平衡而避免过度炎症反应的发生。目前已经证实，机体可表达过多抗氧化、抗炎症功能的蛋白以负调控炎症反应，其中以HO-1研究最为透彻[8]。研究显示，通过诱导HO-1高表达可显著降低细胞因子及炎症介质的含量，抑制粘蛋白表达以及细胞凋亡[9]。这表明HO-1在维持机体的稳态方面发挥重要作用，这可能是机体一种获得性的自我保护机制。研究显示，细菌脂多糖(LPS)刺激THP-1细胞后，可诱导细胞表达HO-1和NQO1，从而抑制炎症因子的过度分泌[10]。马小华的研究结果也显示人工合成的MALP-2可诱导THP-1细胞表达HO-1[6]。

由于支原体的致炎物质主要是LAMPs，因此被本研究选用。在观察LAMPs对HO-1的诱生作用时，首先必须排除LAMPs对THP-1细胞的非特异性损伤以避免干扰实验结果。本研究通过测定LDH的方法发现LAMPs的最大作用浓度为5 μg/mL。

本研究还发现，LAMPs作用THP-1细胞4 h后即可诱导HO-1 mRNA表达，8 h后达到高峰。通过采用转录和翻译抑制剂处理后证实HO-1的表达发生在转录和翻译水平。有研究对LPS处理THP-1细胞后发现，刺激后8 h内检测不到HO-1的表达，这与本研究结果不太一致。这可能与LPS和LAMPs具有不同的受体有关，因为LPS主要是通过TLR4和CD14所识别，而LAMPs则通过TLR2/6，随后所激活的信号通路有所不同所致[11]。

PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，人体单核/巨噬细胞中PI3K主要由调节亚基p85和催化亚基p110构成。当PI3K激活后，可将底物PIP2转化为PIP3。PIP3作为第二信使，最终激活Akt(即，蛋白激酶B)[12]。因此，检测细胞中Akt的磷酸化水平可以间接反应PI3K的活性。本研究发现LAMPs处理THP-1细胞后5 min即可检测出Akt磷酸化，15 min后到达高峰，这表明LAMPs可激活PI3K。为了进一步明确PI3K是否参与HO-1的表达，本研究随后采用PI3K抑制剂LY294002处理THP-1细胞，结果发现HO-1表达显著降低。这表明HO-1的表达可能受PI3K的调控。

Nrf2是参与调控的主要核转录因子。细胞静息状态下，Nrf2在胞浆内与其抑制因子Keap1结合而呈非激活状态。氧化应激、亲电子物质等可使Nrf2从 Keap1中解离并转位至细胞核内与相关基因启动子上的抗氧化反应元件位点结合，从而诱导抗氧化作用的基因转录，发挥其抗氧化或抗炎症作用[13]。本研究发现LAMPs可上调细胞核内Nrf2的DNA结合活性量，这表明LAMPs可激活Nrf2。同时，通过采用PI3K抑制剂处理后，结果显示Nrf2的DNA结合活性明显降低。以上结果表明LAMPs可激活PI3K/Nrf2通路。

HO-1启动子上含有Nrf2的调控位点。为了观察Nrf2是否参与调控HO-1的表达，本研究采用Nrf2特异性siRNA干扰其表达后[14]，结果显示，LAMPs诱导的HO-1表达显著降低。这表明LAMPs诱导HO-1表达是通过PI3K/Nrf2通路而实现的。

综上所述， LAMPs可激活THP-1细胞中PI3K/Nrf2信号通路，并诱导HO-1的表达。但LAMPs与TLR结合后，能否激活其他激酶和信号通路，包括MAPKs，NADPH氧化酶等，以及LAMPs诱生的HO-1能否负调控支原体感染后的炎症反应,尚有待于进一步研究。

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Mycoplasma pneumoniae lipid-associated membrane proteins inducing Heme oxygenase-1 expression via PI3K/Nrf2 in THP-1 cell

LIU Yan1,LIU Dan2,ZHU Cui-ming3

(1.Department of Medical Laboratory, Shaoyang Medical College, Shaoyang 422000, China;2.Shaoyang Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shaoyang 422000, China;3.Institute of Pathogenic Biology, University of South China, Hengyang 421001, China)

The aim of this study is to investigate the mechanisms ofMycoplasmapneumonia-derived lipid-associated membrane proteins (LAMPs) inducing heme oxygenase-1 expression in human mononuclear cell line THP-1 cells. THP-1 cells were culturedinvitro, and treated by different concentration of LAMPs; the mRNA and protein level of HO-1 were detected by real time-PCR and western blot, respectively. Meanwhile, actinomycin D and cycloheximide were administered to pretreat THP-1 cell, subsequently challenged by 5.0 μg/mL LAMPs for 16 hrs, and the expression of HO-1 was detected by western blot. To determine the phosphorylation of Akt and the DNA-binding activity of Nrf2, western blot and electrophoretic mobility shift assay were used to detect the nucleoprotein and cytoplasm protein extracted from the THP-1 cell administered by LAMPs. The PI3K inhibitor LY294002 was also administered to investigate the effects of LAMPs on the activity of Nrf2. At last, siRNA was used to confirm the involvement of Nrf2 in regulation of HO-1 expression. Results showed that (Ⅰ) 0-5 μg/mL LAMPs induced HO-1 mRNA and protein dose-dependent expression in THP-1 cells; (Ⅱ)5 μg/mL LAMPs could induce Akt phosphorylation in THP-1 cells, and raise the DNA-binding activity of Nrf2, and PI3K inhibitor LY294002 could significantly inhibit its activity; (Ⅲ) Silencing of Nrf2 by siRNA could downregulate LAMPs induced HO-1 expression in THP-1 cell. In conclusion, LAMPs could induce HO-1 expression in THP-1 cell via PI3K/Nrf2 pathways.

lipid-associated membrane protein; heme oxygenase-1; nuclear factor related factor-2

Liu Dan, Email: 49467274@qq.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.012

刘丹，Email：49467274@qq.com

1.邵阳医学高等专科学校，邵阳 422000； 2.湖南省邵阳市疾病预防控制中心，邵阳 422000； 3.南华大学病原生物学研究所，衡阳 421001

R375

A

1002-2694(2015)04-0348-05

2014-07-10；

2014-10-29

湖南省教育厅优秀青年项目(14B164)

Supported by the Excellent Young Project of Education Department of Hunan Province (No. 14B164)