刘端勇，黄敏芳，徐 荣，王 馨，邹 勇，岳海洋，黄小英，赵海梅

（1.江西中医药大学科技学院，江西南昌 330025；2.江西中医药大学研究生学院；3.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室；4.江西中医药大学基础医学院方剂教研室，江西南昌 330004）

黄芪多糖对结肠炎大鼠小肠PP结中T淋巴细胞亚群的调节作用

刘端勇1，黄敏芳2，徐 荣2，王 馨2，邹 勇2，岳海洋2，黄小英3，赵海梅4

（1.江西中医药大学科技学院，江西南昌 330025；2.江西中医药大学研究生学院；3.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室；4.江西中医药大学基础医学院方剂教研室，江西南昌 330004）

Effect of Astragalus polysaccharides in regulating the T lymphocyte subgroup in intestinal PPs of rat with colitis

LIU Duan-yong1，HUANG Min-fang2，XU Rong2，WANG Xin2，ZOU Yong2，YUE Hai-yang2，HUANG Xiao-ying3，

ZHAO Hai-mei4
（1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine Science and Technology，Nanchang 330025，China；2.Jiangxi Universi-ty of Traditional Chinese Medcine in Postgraduate，Nanchang 330004，China；3.University of Tranditional Chinese Medicine of the Key Laboratory of Modern Preparation of TCM，Ministry of Education，Nanchang 330004，China；4.Scholl of Basic Medi-cal Sciences in Jiangxi University of Traditional Chinese Medi-cine，Nanchang 330004，China）

网络出版时间：2015－8－10 14：37 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．029．html

黄芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是黄芪的主要活性成分之一，可有效治疗实验性结肠炎［1］，但其能否调节结肠炎大鼠小肠派尔集合淋巴结（peyer’s patch，PP结）中T淋巴细胞亚群水平尚不明确，本实验通过复制实验性结肠炎，观察小肠PP结中T淋巴细胞、CD25＋T淋巴细胞与Th17细胞的表达，以明确APS的可能作用机制。

1　材料

1．1动物及分组 健康SD大鼠60只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，♂，体质量（210±10）g，将大鼠随机分为正常组、模型组、APS（低、中、高剂量）组、美沙拉嗪对照组6组，每组10只，适应性饲养3 d后使用。

1．2药物及试剂 APS购自于陕西森弗生物技术有限公司、美沙拉嗪购自佳木斯鹿灵制药有限公司，2，4，6-trinitro-benzenesulfonic acid（TNBS）来自于Sigma公司。FITC Anti-Rat CD4 mAb、APC Anti-Rat CD3 mAb、PE Anti-Rat CD8a mAb、APC Anti-Rat CD4 mAb、PE Anti-Rat CD25 mAb、FITC Anti-Mouse／Rat Foxp3 mAb和FITC Anti-Rat IL-17 mAb购于ebioscience公司。DMSO、佛波酯、离子霉素、多聚甲醛等均购自美国Sigma公司，RPMI 1640培养液和Hank′s液等均购自美国Gibco公司。

1．3仪器 低温高速离心机（德国Eppendorf）；流式细胞仪（美国BD FACSC Canto II）；CO2恒温培养箱（力新仪器）。

2　方法

2．1造模［2］造模前禁食12 h，除正常组外，大鼠麻醉后，按100 mg·kg－1TNBS计算，将TNBS溶入0.3mL 50%乙醇配制TNBS乙醇复合溶液，将TNBS乙醇复合液注入距肛门约8 cm处，倒置大鼠15 min，放回原笼自然苏醒，正常组注入等容积的50%乙醇。

2．2给药方法 自造模后d 1起，按体重换算，APS低、中、高剂量组分别为200、400、800 mg·kg－1APS，美沙拉嗪对照组给予150 mg·kg－1美沙拉嗪灌胃给药，每日1次，共7 d。

2．3流式细胞术测T淋巴细胞水平 剖腹剪取小肠PP结，置于5%胎牛血清RPMI 1640培养液中，300目不绣钢网碾磨滤过洗涤，离心后弃其上清。取100μL细胞溶液，分别加入CD4 mAb、CD3 mAb、CD8a mAb各0.3 μL，室温下孵育30 min后，离心后弃上清，1%多聚甲醛的PBS固定上机检测。

2．4流式细胞术测CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞的表达取上述细胞悬液，用1μL CD4 mAb、1μL CD25 mAb孵育30min，洗涤后，透膜固化液孵育1 h，加1 μL Foxp3 mAb孵育1h后，1%多聚甲醛PBS溶液固定后上机待测。

2．5流式细胞术测Th17细胞水平 PP结淋巴细胞悬液用50 μg·L－1PMA和1 g·L－1离子霉素刺激，恒温培养箱中培养2 h，加蛋白转运抑制酶布雷菲德菌素A继续培养4 h后，用1 μL CD4、1 μL CD25 mAb孵育30 min，再经洗涤后，透膜固化液孵育1 h，加1 μL IL-17 mAb孵育30 min后，上流式细胞仪检测。

2．6统计学方法 采用SSPS 13.0软件进行统计学分析，检测结果均以±s表示，组间比较采用t检验。

3　结果

3．1流式细胞术测定小肠pp结CD4＋、CD8＋T淋巴细胞水平 APS高、中剂量组组CD4＋T淋巴细胞水平与模型组比较均明显下降（P＜0.05或P＜0.01）；CD8＋T淋巴细胞水平和CD4／CD8比值，则除低剂量组外，其他各组较模型组明显降低（P＜0．05或P＜0．01）。

3．2流式细胞术测CD4＋CD25＋Foxp3＋T淋巴细胞及Th17细胞水平 Th17淋巴细胞水平仅见中剂量组较模型组明显降低（P＜0.05）；而CD4＋CD25＋Foxp3＋T淋巴细胞水平和CD25／Th17比值，则可见APS高、中剂量组比模型组明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。

4　讨论

PP结是肠黏膜免疫系统的重要组成部分，在结肠炎症发生后，PP结中CD4＋和CD8＋T淋巴细胞平衡被打破，肠道黏膜免疫平衡遭到破坏，肠黏膜屏障破坏，炎细胞浸润，粘膜损伤发生［3］。CD25＋T淋巴细胞和Th17细胞都是CD4＋T细胞亚群，其二者功能恰恰相反，Treg细胞维持免疫耐受和抑制炎症反应，而Th17细胞则多产生致炎因子而促进炎症发生，二者失衡是炎症性肠病的重要发病机制之一，因此调节二者之间的平衡是治疗IBD的主要策略之一［4］。本实验中模型组小肠PP结中CD4／CD8升高、CD25／Th17降低，说明结肠炎大鼠肠黏膜免疫失衡。APS高、中剂量组均可降低CD4＋T淋巴细胞数量、调高CD8＋T淋巴细胞水平，同时明显降低CD4／CD8比值，升高CD25＋T细胞水平和CD25／Th17比值，且APS中剂量还可降低Th17细胞水平，说明APS在一定剂量下可能降低CD4T及Th17细胞淋巴细胞，调高CD8＋、CD25＋T淋巴细胞，降低CD4／CD8及升高CD25／Th17来调节T淋巴细胞亚群的平衡，从而降低异常免疫反应的程度，减轻炎症损伤，从而有效治疗实验性结肠炎。

参考文献：

［1］ Yang M，Lin H B，Gong S，et al．Effect of Astragalus polysaccha-rides on expression of TNF-α，IL-1β and NFATc4 in a rat model of experimentalcolitis［J］．Cytokine，2014，70（2）：81－6．

［2］ 于海食，陈 浩，洪 缨，等．肠安康新组方抗溃疡性结肠炎大鼠的机制研究［J］．中国药理学通报，2012，28（2）：282－5．

［2］ Yu H S，Chen H，Hong Y，et al．Mechanisms of new Chang-an-kang on ulcerative colitis in rat［J］．Chin Pharmacol Bull，2012，28（2）：282－5．

［3］ Yu X Y，Zou C L，Zhou Z L，et al．Phasic study of intestinal ho-meostasis disruption in experimental intestinal obstruction［J］．World J Gastroenterol，2014，20（25）：8130－8．

［4］ Sakaguchi S，Ono M，Setoguchi R，et al．Foxp3＋CD25＋CD4＋natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoim-mune disease［J］．Immunol Rev，2006，212（6）：8－27．

中国图书分类号：R-332；R284．1；R322．45；R392．12

关键词：黄芪多糖；结肠炎；CD4；CD8；CD25；Th17

Key words：Astragalus polysaccharide；colitis；CD4；CD8；CD25；Th17

作者简介：刘端勇（1975－），男，博士，副教授，E-mail：liuduanyong＠163．com；黄小英（1975－），女，硕士，助理研究员，研究方向：中西医结合临床基础，通讯作者，E-mail：8842100＠qq．com；赵海梅（1979－），女，博士，副教授，研究方向：溃疡性结肠炎与中药免疫药理学，通讯作者，Tel：0791-86588407，E-mail：haimei79＠163．com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 81460679，81260595）；江西省自然科学基金项目（No 20122BAB215046）；江西省卫生厅中医药科研计划（No 2012A017）

收稿日期：2015－05－12，修回日期：2015－06－23

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）09－1328－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．029