谈国仓

(青海省湟源县畜牧兽医站,青海湟源 812100)

一株猪伪狂犬流行株的分离与鉴定

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(青海省湟源县畜牧兽医站,青海湟源 812100)

猪伪狂犬是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染猪引起的急性传染病，该病毒属于疱疹病毒科（Herpesviridae）α-疱疹病毒亚科，与人源单纯疱疹病毒（HSV-1、HSV-2）、水痘带状疱疹病毒（VZV）及I型马牛疱疹病毒（BHV-1、EHV-1）等同属[1]。猪伪狂犬在世界上分布广泛，临床症状与狂犬病相似，曾被误认为是狂犬病[2]。目前，伪狂犬病疫情仍在蔓延扩大，全世界因伪狂犬病造成的经济损失每年可达数十亿美元，仅低于口蹄疫和猪瘟等一类疫病。猪伪狂犬病在我国多个省份广泛流行，严重影响了猪场的生产水平。近年来，伪狂犬病病源不断发展变化，在流行时出现了毒力增强现象，给该病的净化和预防带来了新的压力。

猪是伪狂犬主要的自然宿主和传染源。除高级灵长类外PRV能有效地感染哺乳动物和部分禽类，宿主范围广阔。猪感染后，种猪繁殖障碍，母猪出现流产、死胎、木乃伊胎等为主要临床症状，公猪则表现为不育，仔猪多以高热、呼吸困难、食欲废绝、腹泻、震颤、运动失调，一般情况下幼龄仔猪发病率和死亡率高达100%，严重者昏迷直至死亡，育肥猪常引发生长发育障碍，饲料利用率低[3]。家畜或野生动物感染PRV后，主要表现以发热、奇痒（猪除外）、脑脊髓炎等症状的急性传染病，且猪体内存在潜伏感染。PRV是一种致病性强、可感染多种动物的病毒。在自然条件下，猪伪狂犬病常发生于猪、牛、羊、犬、鼠类等，其中猪最为普遍。家兔、豚鼠、小鼠等实验动物都易感该病，其中以家兔最为敏感。本病主要经呼吸道、消化道感染，经皮肤黏膜、伤口等也可感染发病，也可经交配、精液、胎盘垂直传播，带毒猪配种时可相互感染，感染怀孕母猪可传染胎儿，幼猪可经母猪乳汁感染。空气是PRV传播的最主要途径，同时污染的饲料、吸血昆虫、带毒鼠、羊等也可传播本病。PRV在感染的急性后期存在一个潜伏感染期，主要潜伏在三叉神经节、嗅球和扁桃体内。期间PRV持续存在于感染部位但不产生具有感染力的病毒。潜伏感染的猪是病毒活化、散毒和在易感猪群中传播的传染源。当外界因素等造成猪机体免疫力下降时，潜伏的病毒转化为感染性的病毒。PR潜伏期一般为3～6 d，多则可达10 d。潜伏感染的猪一直是使病毒活化、散毒和在易感猪群中传播的传染源。受外界不良因素等应激造成猪免疫力减弱时，潜伏状态的病毒可转化为具有感染性的病毒[4]。对伪狂犬病毒流行株的分离鉴定及其生物学特性分析，有利于深入了解伪狂犬流行病学，为控制该病的传播及新型疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料及实验动物

疑似伪狂犬病病料采自当地某发病猪场病死猪脑组织，6周龄BALB/c小鼠等。

1.1.2 试剂

DMEM细胞培养基（Invitrogen）、胎牛血清（购于杭州四季青生物工程公司），pMD18-T载体、病毒基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA Marker I（均购于宝生物工程（大连）有限公司），伪狂犬阳性、阴性标准血清、PK-15细胞及伪狂犬标准株均由中国农科院提供，PBS，96孔细胞培养板。

1.2 方法

1.2.1 病料处理

无菌条件下将采取的病料剪碎后，加入5倍体积的无菌PBS，用无菌研磨棒研磨处理后，置于低温条件下反复冻融3次，6 000 rpm离心30 min，取上清，加入青链霉素，无菌条件下经0.22 μm微孔滤膜过滤后冻存备用。

1.2.2 病毒的培养

将0.5ml病毒滤液接种于单层PK-15细胞培养瓶内，同时设定阴性对照即将等量的PBS接种于另一单层PK-15细胞培养瓶内，37℃孵育1 h后弃去液体，加入含2%胎牛血清的DMEM细胞培养液约10ml，置于5% CO2细胞培养箱中连续传代培养，并观察记录细胞病变情况，当细胞出现细胞病变稳定时，终止培养并收集病毒液，并于-80℃ 超低温冰箱中保存。

1.2.3 TCID50测定

将上述收集的病毒液用DMEM细胞培养液作10倍系列梯度稀释，稀释后病毒浓度依次为10-1-10-8，取各梯度病毒稀释液100μl分别接种到长成单层PK-15细胞的96孔培养板上，同时将培养板最后两列孔接种DMEM细胞培养液设为阴性对照，将加好样的96孔培养板置于37℃体积比为5% CO2细胞培养箱中培养观察细胞病变情况，然后按照Reed-Muench法计算分离病毒的TCID50

1.2.4 分离病毒的PCR检测

[6]参照GenBank中伪狂犬高度保守基因序列设计引物，上游引物序列：5’-CACGGAGGAGGAGCTGGGGCT-3’；下游引物序列：5’-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3’，扩增约217 bp的DNA片段，由上海生工生物工程有限公司合成。

首先利用病毒基因组提取试剂盒提取收集的病毒液和标准株DNA，然后以此DNA 为模板进行PCR扩增，反应体系为Premix Ex Taq酶12.5μl，上、下游引物各0.5μl，模板DNA 1 μl，补充无菌双蒸水至总体积25μl；反应条件为：95℃ 5min，95℃ 30s，63℃30s，72℃ 30s，30个循环；72℃延长10min，4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪记录结果。将鉴定正确的片段连入pMD18-T载体，转入感受态细胞扩增，提取质粒后，送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.5 动物回归试验

将伪狂犬标准株和收集病毒液分别稀释成含101-106TCID50的稀释液，每个稀释度腹股沟皮下按100μl/只分别接种5只6周龄BALB/c小鼠，并观察记录试验动物临床发病症状及死亡情况，同时设注射DMEM细胞培养液的5只小鼠作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 细胞病变观察结果

收集的病毒液接种PK-15细胞连续传代培养后，出现了明显的细胞病变，48h内细胞空洞、变圆、变小，并伴随拉丝病变，约72h可见明显的细胞脱落现象。

2.2 TCID50测定结果

根据分离病毒株不同稀释度接种96孔细胞板PK-15细胞后出现的病变情况，利用Reed-Muench法进行毒价TCID50测定，结果TCID50=l0-5.19/0.1ml（详见表1）。

2.3 PCR鉴定结果

以病毒液DNA为模板，进行PCR扩增，凝胶成像仪下可见清晰目的条带（见图1），连接产物经纯化后测序鉴定为预期基因。

2.4 动物回归试验结果

小鼠接种稀释后的分离株病毒液和标准株病毒液后约24h，出现了精神沉郁、打盹、食欲降低、不爱活动等临床表现，48h后有的小鼠出现了后肢麻痹、被毛逆立、怕冷、注射部位奇痒、啃咬奇痒皮肤等典型伪狂犬症状，72 h后逐渐有小鼠死亡。但是该分离病毒株的半数致死量（LD50）显著低于伪狂犬标准株。

3 讨论

谈国仓（1983-），男，青海西宁人，本科，研究方向:兽医临床。