何观虹，姚丽

MicroRNA在肺动脉高压发病机制中作用的研究进展

何观虹，姚丽

MicroRNA（miRNA）是一类在转录后水平上调节基因表达的非编码小分子 RNA，在生物体生理、病理等过程中发挥重要作用。近年来研究发现，miRNA参与细胞增殖分化、细胞凋亡、免疫反应、肿瘤发生等多种病理生理过程，在心血管系统信号网络调控中起到重要作用［1-2］。

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是仅次于冠心病和高血压的第三类常见心血管疾病，发病率和死亡率都很高。肺动脉压力进行性升高的主要机制为血管收缩、重构和血栓形成。研究发现，miRNA参与 PAH中血管收缩和重构中多物质的调控，本文将对 miRNA在 PAH调控中的具体机制作一综述。

1 miRNA形成及作用机制

miRNA的生物合成可以分为前体转录、出核转运及成熟这几个过程［3］，成熟 miRNA通过沉默靶基因，在分化、增殖、细胞凋亡和代谢等过程发挥生物学效应。miRNA和靶 mRNA作用方式主要有两种，一是其与靶 mRNA的3'非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）不完全互补配对［4］，阻断该基因的翻译过程，影响蛋白表达水平，但不影响mRNA的稳定性；二是miRNA和靶mRNA完全互补配对使靶 mRNA在互补区特异性断裂，导致基因沉默。

2 miRNA在肺动脉高压发病机制中的作用

2.1 miRNA在肺部的表达

目前，PAH患者miRNA表达谱中共有 78个差异表达位点，62个显示上调（miR-135a、miR-130a、miR-27b等），16个下调（miR-147、miR-92b等）［5-6］。PAH患者血浆中58种 miRNA的浓度变化中，miR-150下调程度最大。晚期 PAH大鼠肺组织中有 30个 miRNA表达明显上调（miR-122、miR-130a、miR-146b等），7个 miRNA显著下调（miR-382、miR-192、miR-29c等）［7］。在野百合碱诱导的 PAH大鼠模型和 PAH患者 miR-21的水平均下调，miR-405水平均上调［8-9］。

2.2 miRNA对肺血管组分的调控作用

miRNA参与肺血管收缩和重构。既调控血管内皮细胞和成纤维细胞的增殖、凋亡、促进血管新生，又在血管平滑肌细胞增殖、凋亡及表型转化方面起重要作用，进而在肺血管收缩和重构各个环节中发挥功能。

2.2.1 miRNA对内皮细胞的调控作用 缺氧条件下，内皮细胞中 miR-21表达使二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶 1（dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1，DDAH1）表达下调，进而造成内皮细胞功能障碍，而 miR-21拮抗剂以及 DDAH转染可以阻断该表达下调，提高环鸟苷酸（cGMP）水平进而改善肺动脉高压［10］。另外，miR-21的模拟物证实可以下调程序性死亡因子 4（programmed cell death protein-4，PDCD4）的表达，抑制 PDCD4/caspase-3凋亡通路从而抑制内皮细胞的凋亡［11］。

在内皮细胞中，缺氧诱导 miR-27a的表达，使内皮素-1（endothelin-1，ET-1）表达增加，过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ， PPARγ）表达下降，进而促进内皮细胞增殖。而且，PPARγ的配体 RSG能够下调缺氧所诱导的 miR-27a，证实PPARγ与 miR-27a的负反馈调节与 PAH的发生相关［12］。

miR-126是内皮型的 miRNA，在 PAH中表达上调，由于 miR-126靶定位 Spred-1和 PIK3R2基因，使其能促进动脉环模型的血管新生，加重血管重构［13-14］。

胎盘生长因子（placenta growth factor，PIGF）诱导内皮细胞 miR-199a2的表达下调。miR-199a2靶定缺氧诱导因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）mRNA的 3'-UTR，进而使 ET-1的表达增强。位于 DNM3os转录区的 miR-199a2受 PPARα的调控，因此 PPARα激动剂非诺贝特能够上调 miR-199a2和 DNM3os的表达，降低ET-1的水平，从而减轻肺动脉高压［15］。另外，PIGF通过下调 PAX5表达，抑制内皮细胞中 miR-648的表达，增强ET-1表达［16］。

在 PAH中，miR-424与 miR-503表达下调，抑制内皮增殖，抑制内皮依赖性中间物分泌，进而抑制内皮诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖［17］，而这种表达下调受肌细胞增强因子 2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）的调控。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以提高 MEF2的活性，从而抑制内皮细胞的增殖和迁移，对肺动脉高压动物模型具有治疗作用［18］。

2.2.2 miRNA对平滑肌细胞的调控作用

2.2.2.1 miRNA影响平滑肌细胞的收缩性 缺氧使肺血管 miR-190表达上调，研究者发现合成的 miR-190类似物促进苯肾上腺素和氯化钾预收缩肺动脉的收缩以及肺动脉平滑肌细胞外钙内流。电压门控型钾通道亚家族 Kcnq5 的 mRNA被证实为 miR-190的靶点。miR-190反义寡核苷酸可有效减轻 miR-190对肺动脉平滑肌细胞和肺动脉的作用。综上，miR-190通过促进肺动脉平滑肌细胞外钙内流，在缺氧诱导肺动脉收缩中起重要作用［19］。

miR-130/301通过调控 PPARγ调控肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞之间一系列的血管收缩因子，如 ET-1，进而促进肺动脉的收缩［20-21］。

2.2.2.2 miRNA影响平滑肌细胞的增殖和凋亡 最早发现 miRNA与肺血管平滑肌的关系是在受伤血管平滑肌中发现了 miRNA的表达上调。在 PAH中，miR-17-5p、miR-21等表达上调，miR-124、miR-204等表达下调，促进平滑肌细胞增殖、迁移，抑制平滑肌细胞凋亡。

在人肺动脉平滑肌细胞中，缺氧诱导产生的精氨酸酶 II是由 miR-17-5p调控的，进而介导平滑肌细胞的增殖，且精氨酸酶 II与 miR-17-5p之间存在着反馈［22］。

miR-21在受伤的颈动脉中表达上调，而后发现miR-21通过沉默张力蛋白同源基因（PETN）的表达及增加bcl-2的表达，促进平滑肌细胞的增殖［23］。缺氧可诱导人肺动脉平滑肌中 miR-21表达量增加 3倍，同时伴随miR-21靶蛋白 PDCD4、SPRY2及 PPARα的下调，进而促进肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移［24］。

miR-124通过靶定NFATC1、CAMTA1和 PTBP1基因抑制了活化 T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）活性、磷酸化和核迁移程度，进而抑制了肺动脉平滑肌细胞的增殖能力［25］。

miR-130a在 PAH肺动脉组织中的表达显著上调，且呈时间依赖性。通过miR-130a模拟物证实 miR-130a促进血管平滑肌增殖，且可被其 miR-130a阻断剂抑制，该作用可能介导 PAH肺血管重构［26］。

miR-138在缺氧条件下表达上调，内源性的 miR-138抑制平滑肌细胞凋亡，抑制 caspase活性同时干扰 bcl-2信号通路。哺乳动物 STE20样激酶 1（Mst1）是细胞凋亡的标志性酶，其活性以及蛋白激酶 B（Akt）信号通路都在miR-138对肺动脉平滑肌凋亡抑制作用中起重要作用［27］。

miR-204在肺循环中的功能和数量要远大于其他血管，而 miR-204在 PAH患者和 PAH大鼠的肺动脉平滑肌细胞表达下调［28］，这种下调可以使肺动脉平滑肌细胞呈增殖和抗凋亡表型，且下调程度与 PAH严重程度相关。研究发现信号传导及转录激活因子 3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT-3） 的激活可以抑制miR-204的表达，使蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP2的表达上调，从而激活 Src激酶和 NFAT。NFAT和 SHP2能够维持PAH-PASMC的增生和抗凋亡作用，而 STAT-3则被认为促进平滑肌细胞增殖和血管壁增厚。另外，miR-204的靶蛋白转化生长因子（transforming growth factor β，TGF-β）、表皮细胞生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、叉头蛋白 C1（forkhead box protein C-1，FOXC-1）、成骨特异性转录因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、多聚 ADP核糖聚合酶 1（poly ADP-ribose polymerase，PARP-1）等都对平滑肌细胞生理调节起着重要作用［29-33］。

miR-206在缺氧肺动脉平滑肌中高表达，增加平滑肌分化标志——α肌动蛋白和钙调蛋白的表达，促进平滑肌细胞的增殖和分化。而且，miR-206的过度表达能够下调肺动脉高压发病过程一个重要因子——Notch-3的表达［34］。

miR-210是由 HIF-1α诱导的一种重要的 miRNA。 miR-210可以通过抑制E2F转录因子 3（E2F3）的表达抑制缺氧诱导的平滑肌细胞凋亡［35］。另外，研究发现抑制miR-210的表达能够提高丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1（mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1）的表达，抑制人平滑肌细胞的增殖，但 miR-210过表达虽然抑制 MKP-1表达但对细胞增殖没有影响［36］。

miR-328在缺氧肺动脉环中的表达下调，通过抑制L型钙通道的表达来降低肺动脉收缩和重构的程度，且通过抑制胰岛素生长因子 I受体（insulin-like growth factor I receptor，IGF-IR）表达抑制肺动脉平滑肌的凋亡［37］。

通过比较缺氧 miR-451基因敲除大鼠与 miR-451拮抗剂作用的大鼠模型的作用，miR-451对平滑肌细胞增殖和转移的促进作用机制进一步被阐明，结果显示短暂的抑制miR-451能够抑制缺氧条件下肺动脉高压的发展，但将miR-451敲除则对平滑肌细胞的增殖及肺动脉高压的发展无影响［38］。

2.2.2.3 miRNA促进平滑肌细胞表型转换 miR-9参与缺氧诱导的平滑肌细胞的表型转换。研究者发现，miR-9基因敲除抑制平滑肌细胞的增殖和收缩蛋白基因的表达，而常氧条件下 miR-9的过表达促进平滑肌细胞增殖表型。而缺氧条件下通过调节 HIF-1α上调 miR-9-1和 miR-9-3的表达，在平滑肌细胞表型转换中发挥作用［39］。

miR-17和 miR-21具有促进肺动脉平滑肌肌化和血流动力的作用。Pullamsetti等［40］使用 miR-17与 miR-21的拮抗剂降低肺动脉平滑肌的肌化程度。miR-21通过沉默PDCD4基因增加血管平滑肌细胞中 TGF-β家族诱导的收缩蛋白，从而增强 Pri-miR-21转录为成熟 miR-21，增强平滑肌细胞收缩蛋白表达的能力［41］。

miR-24是平滑肌细胞中 PGDF-BB和 TGF-β家族的对抗点，参与平滑肌细胞表型转变。血小板源性生长因子（PDGF）和 TGF-β1是调节血管生长和重构的主要因子，在 PAH中调节血管平滑肌细胞表型转化。TGF-β1通过Smad通路增加收缩型表型。PDGF-BB诱导 miR-24的表达上调，沉默 Trp3的表达，间接减少 smad1表达［42］。miR-24的过表达减少 smad2和 smad3，减少 TGF-β介导的 smad2的激活。

2.2.3 miRNA对成纤维细胞的调控作用 在 PAH中，成纤维细胞的增殖、迁移及炎症细胞因子分泌的增加导致肺动脉外膜的重构。研究者在 PAH患者及 PH实验模型中分离的成纤维细胞中均发现了 miR-124表达的减少。通过模拟物转染使 miR-124过表达能够减轻肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移。miR-124可抑制单核细胞趋化蛋白 1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和核糖核酸结合蛋白 1 （polypyrimidine tract binding protein 1，PTBP-1）的表达，通过 Notch1/phosphatase and tensin homolog/FOXO3/p21Cip1 与 p27Kip1抑制成纤维细胞的增殖和迁移［43］。

2.3 miRNA对 BMPR-II的作用

BMPR-II的失调或变异被认为是多种肺动脉高压的标志［44］。Brock等［45］发现 miR-17/92家族的 miR17-5p和miR-20a靶定肺动脉内皮细胞上的 BMPR-II。IL-6通过激活 STAT3上调 miR-17/92的表达，进而抑制 BMRP-II的表达，促进肺动脉内皮细胞的增殖。miR-17/92还受 c-Myc 及 E2F1调控［46-47］。miR-20a的抑制剂 antagomiR-20a增强肺组织中 BMPR-II的表达，同时减轻肺血管壁增厚和微小动脉的闭塞，从而减轻了肺血管重构的程度［48］。

miR-21通过骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、BMPR-II及 Rho/Rho-kinase信号通路来实现对肺血管紧张性和舒张性的调控。缺氧及 BMPR-II可以上调肺血管内皮细胞 miR-21的表达，也可降低 RhoB和 Rho激酶的表达，进而使肺血管收缩［49］。

MiR-143/145位于细胞平滑肌，它的靶蛋白包括心肌蛋白、平滑肌肌球蛋白重链，miR-145在重构血管平滑肌表达上调。Caruso等［50］通过 PCR手段检测出在缺氧大鼠肺平滑肌 miR-145表达增加，BMPR-II变异可以使大鼠和 PAH患者的 miR-145表达上调。

3 miRNA在肺动脉高压治疗中的应用

随着 miRNA研究不断深入，开始出现针对 miRNA的肺动脉高压治疗方法。miRNA靶点的预测将成为药物开发的突破口，目前已经有生物信息工具可以预测 miRNA的靶点［51］。研究者利用 miR-21过表达试剂，在肺动脉平滑肌中通过链霉亲和素磁珠检测发现 miR-21的靶mRNA，通过 Affymetrix微距阵分析发现其靶基因［52］。

载脂蛋白 A-I模拟肽 4F能够通过诱导 miR-193-3p治疗肺动脉高压。Sharma等［53］通过建立野百合碱以及缺氧诱导的肺动脉高压大鼠模型，发现 4F干预组大鼠肺动脉高压显著改善，且该作用与 miR-193-3p的上调相关，4F通过上调 miR-193-3p抑制脂肪氧合酶和胰岛素生长因子 1发挥作用。

另外，通过 miRNA分析发现 PAH患者血浆白细胞层miR-451、miR-1246表达下调，血浆中 miR-23b、miR-130a 及 miR-190明显上调，这些 miRNA都可以成为肺动脉高压早期诊断的生物标志物［54］。

4 展望

miRNA是一类长度 18～26 nt的非编码单链小分子RNA，来源于能够形成分子内茎环结构的前体，由其中的一条臂加工而成。其发现仅有短暂的几十年，但因序列、结构以及在各类脏器中稳定的表达，使其成为心血管疾病一个重要的研究靶点。miRNA最大的生物学特性在于单个miRNA可以调控作用于多个靶点，同时一个靶基因或蛋白又同时受多个 miRNA调节，调控机制相对复杂，但又因此特性使 miRNA成为治疗肺动脉高压药物的潜力靶点。

miRNA主要通过作用于 PAH发病过程中传导通路靶蛋白及靶基因而发挥作用，影响肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞的增殖和凋亡，参与肺血管收缩和重构过程的调节作用。

miRNA治疗可能会出现以下几个问题：第一，尽管证明了miRNA参与PAH的发病过程，但如何在PAH中调控 miRNA成为一个关键问题，需要对 miRNA的信号传导进行深入研究。研究中发现敲除 miRNA可能会引起通路反馈机制导致治疗失效，这是值得注意的问题。miRNA通过传统方法的导入（如静脉注射），其调控作用是否会出现，是否会对其他非目的基因产生影响仍然未知。第二，miRNA的靶基因、靶蛋白在不同细胞中可能不同，仍需要有更好的方法能够精确地预测并验证 miRNA的靶点，有利于更好地了解其生物功能。第三，miRNA治疗需要的长期和短期操控技术尚未达到应有的水平，治疗因子的稳定性尚不能保证。第四，miRNA治疗同时需要 miRNA水平的增加和减少，目前尚不能精准调控。这些都将成为未来miRNA在 PAH领域研究的目标。

综上，miRNA是 PAH发病过程中的关键分子，研究它对 PAH发病过程中网络信号的调控机制，可以将对PAH的治疗从过去的“一个药物，一种基因，一种疾病”方式晋升成多靶点药物治疗，既提升了治疗效果，又降低了药物的毒副作用，为更多 PAH患者带来福音。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.014

国家自然科学基金青年项目（81302764）；高等学校博士学科点专项科研基金资助课题新教师类（20122307120011）；黑龙江省自然科学基金（QC2011C021）；哈尔滨医科大学药学院大学生创新基金项目

150081哈尔滨医科大学药学院

姚丽，Email：yaoli197966@tom.com

2014-12-12