■包玲玲 敖长金 萨茹丽 王 园 王翠芳 王思珍

（1.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028000）

沙葱作为葱属植物，主要分布在我国内蒙古自治区中西部及西北等地区的荒漠化草原上，是一种资源丰富的植物，也是放牧绵羊喜爱采食的牧草。刘丽娟等[1]研究发现，黄酮类化合物是葱属植物的主要活性成分之一，是植物在长期自然选择过程中产生的次级代谢产物。由于葱属植物中已知的黄酮类化合物均含有酚羟基结构，因此是较好的抗氧化剂。卢媛等[2]研究指出，舍饲肉羊饲料中添加采食沙葱冻干粉可以显著降低肉羊的发病率，提高生长速度，改善羊肉风味，并且显著提高体外培养液中干物质降解率、挥发性脂肪酸浓度和产气量。张巧娥在精粗比为30∶70日粮条件下，通过添加沙葱水溶性提取物和沙葱脂溶性提取物研究了对绵羊瘤胃发酵的影响。结果表明，沙葱水溶性提取物和脂溶性提取物均能改善瘤胃内环境，促进瘤胃发酵[3]。本研究是在前期研究的基础上，进一步研究沙葱黄酮类化合物对绵羊瘤胃发酵的影响，以期筛选绵羊日粮中沙葱黄酮类化合物的适宜添加量，为沙葱及其深加工产品在肉羊养殖中的进一步应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 沙葱采集

采自内蒙古自治区鄂尔多斯市鄂托克前旗天然草场，依据萨茹丽（2014）报道方法提取沙葱黄酮类化合物[4]。

1.1.2 试验动物饲养管理与日粮配方

选取4只健康、平均体重为(34.6±1.5)kg的蒙古羯羊，通过手术安装永久性瘤胃瘘管，用于采集瘤胃液。试验日粮按代谢能维持需要1.2倍的营养水平配制。试验日粮组成及营养水平见表1。日粮配方精粗比为30∶70，试验日粮的饲喂总量按照试验羊体重的2%（450 g），每天8:00和18:00分两次等量饲喂。试验羊于试验前驱虫，单笼饲养，自由饮水。

表1 试验日粮组成及营养水平

1.1.3 试验仪器

酶标仪(Biotek Synergy H4)、气相色谱仪(惠普5890-Ⅱ型)、恒温水浴锅(HZH-S)、低温高速离心机(GL-21型)、PHS-3B型酸度计。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

沙葱黄酮类化合物的添加量根据张巧娥[3]试验结果得出的水溶性、脂溶性提取物的最佳添加水平分别为335 mg/kg日粮、20 mg/kg日粮来确定。在各发酵瓶中装入2 g培养底物，分别添加培养液30 ml、瘤胃液15 ml、不同比例（0.000、0.022、0.032、0.042、0.052 mg）沙葱黄酮类化合物，混合均匀后放置39℃恒温水浴摇床上进行24 h培养。预设4、9、14、19、24 h，5个采样时间点，各组在每个预设采样时间点均设3个重复。缓冲液的配制参照霍鲜鲜(2003)[5]。

常量元素药剂：准确称取KH2PO4292 mg、NaCl 200 mg、MgSO4· 7H2O 100 mg、（NH4）2SO4480 mg、Na2CO34 000 mg、K2HPO4·3H2O 382.51 mg用蒸馏水定容至1 000 ml。

微量元素药剂：准确称取Na2EDTA 500 mg、Mn⁃Cl2·4H2O 200 mg、FeSO4·7H2O 200 mg、CoCl2·6H2O 20 mg、CuCl2·2H2O 1.0 mg、NaMoO43.0 mg、NiCl2·6H2O 2.0 mg、ZnSO4·7H2O 10 mg、H3BO330 mg，用蒸馏水定容至1 000 ml。

还原液药剂：准确称取Na2S·9H2O 25 g用蒸馏水定容至100 ml。

1.2.2 样品采集

发酵至4、9、14、19、24 h时，记录体外产气量，收集各时间点各处理组培养液，立即测定pH值后，用四层纱布过滤，收集滤液，去除残渣，收集的滤液4 000 r/min离心10 min，用移液枪吸出0.5 ml上清液，置于预先装好4.5 ml 0.2 M HCl的10 ml离心管中，并用手摇匀放入-20℃冰箱，待测氨态氮(NH3-N)浓度；再用5 ml的移液枪吸取4 ml上清液，移入预先装有1 ml 25%的偏磷酸（HPO3）和蚁酸（CH2O2）混合液（3∶1）的10 ml离心管中，冷藏-20℃冰箱，用来待测挥发性脂肪酸（VFA）浓度；剩余的上清液缓慢吸入20 ml离心管中，-20℃保存，用来测定菌体蛋白（BCP）浓度；采样的过程中，每次样品采集结束后，该时间点的培养瓶弃用。

1.2.3 测定指标及方法

1.2.3.1 产气量的测定

分别在4、9、14、19 h和24 h记录每个样品产气量，气体收集装置为医用注射器，最大容积为30 ml。

1.2.3.2 pH值的测定

培养4、9、14、19 h和24 h后，立即用pHS-3B酸度计测定滤液pH值。

1.2.3.3 瘤胃液氨氮（NH3-N）浓度的测定

瘤胃液中氨态氮的测定方法参照冯宗慈等的方法进行[6]。培养结束后取出培养瓶，4层纱布过滤，滤液移至10 ml离心管，4 000 r/min离心15 min，去除原虫和饲料残余颗粒。使用苯酚-次氯酸钠比色法测定上清液中NH3-N含量。

1.2.3.4 菌体蛋白（BCP）测定

菌体蛋白测定参照Cone等阐述方法[7]。培养结束后，样品前处理同NH3-N含量测定。采用考马斯亮蓝法测定上清液中菌体蛋白含量。

1.2.3.5 挥发性脂肪酸（VFA）的测定

用日本岛津GC-7A气相色谱仪(惠普5890-Ⅱ型)法进行测定培养液中挥发性脂肪酸（VFA）的浓度。

1.3 统计分析

本试验数据初步用EXCEL整理后，统计采用SAS 8.0版软件中单因素方差分析（ANOVA）进行，差异显著时采用Duncan's法进行多重比较。当P＜0.05时，表示差异显著。

2 结果

表2 沙葱黄酮类化合物对绵羊瘤胃微生物体外发酵产气量的影响（ml）

如表2所示，各处理组间在整个培养期内产气量变化趋势一致，均呈现上升趋势。与对照组相比，沙葱黄酮类化合物添加组各培养时间点的产气量均极显著提高（P＜0.01），其中0.032 mg沙葱黄酮类化合物添加组瘤胃产气量为最高；0.022、0.042、0.052 mg沙葱黄酮类化合物添加组间差异不显著（P＞0.05）。

表3 沙葱黄酮类化合物对绵羊瘤胃微生物体外发酵pH值的影响

如表3所示，整个培养期内瘤胃pH值有下降的趋势，培养4～14 h时，与对照组相比，沙葱黄酮类化合物组并不显著影响体外发酵pH值；19～24 h时，0.032、0.042 mg沙葱黄酮类化合物添加组pH值极显著高于对照组和其他试验组（P＜0.01）。

由表4结果可以看出，在整个培养期内添加沙葱黄酮类化合物组与对照组的NH3-N浓度变化趋势一致。整个体外培养期内，4、14、19 h时0.032 mg和0.042 mg沙葱黄酮类化合物添加组NH3-N浓度极显著低于对照组和其他试验组（P＜0.01）；9、24 h时0.032 mg和0.042 mg沙葱黄酮类化合物添加组NH3-N浓度显著低于对照组和其他试验组（P＜0.05）。

由表5果可以看出，在整个培养期内（4～24 h），0.042 mg沙葱黄酮类化合物添加组培养液中BCP浓度极显著高于对照组和其他试验组（P＜0.01）。

由表6结果可以看出，整个培养期内各组的VFA浓度逐渐上升的趋势。整个培养期内，0.022、0.032、0.042 mg沙葱黄酮类化合物添加组的VFA浓度极显著高于对照组（P＜0.01），其中0.042 mg添加组最高，0.032 mg添加组次之。0.052 mg沙葱黄酮类化合物添加组的VFA浓度极显著低于对照组和其他试验组（P＜0.01）。

表4 沙葱黄酮类化合物对绵羊瘤胃微生物体外发酵氨态氮浓度的影响（mg/100 ml）

表5 沙葱黄酮类化合物对绵羊瘤胃微生物体外发酵菌体蛋白浓度的影响(mg/100 ml)

表6 沙葱黄酮类化合物对绵羊瘤胃微生物体外发酵VFA的影响(mM/l)

3 讨论

体外批次培养法是一种用来评价反刍动物饲草料营养价值的经典方法，得到了发达国家的普遍采用。这种方法具有较好地模拟反刍动物瘤胃发酵过程和较准确预测体内营养物质消化率的优点。当然对于静态的瘤胃液培养，它也存在许多的问题，即它脱离了活体内瘤胃壁对发酵产物的吸收和瘤胃壁向瘤胃内分泌某些活性物质。

产气量是反映反刍动物瘤胃发酵水平高低的直接标志。瘤胃发酵产气量与饲料底物在瘤胃中的发酵水平呈正相关，产气量越大，瘤胃发酵水平越高[8]。卢媛（2002）[2]研究发现，饲喂沙葱冻干粉可以提高体外发酵产气量，本试验也同样得出，添加不同浓度的沙葱黄酮类化合物后，也显著提高瘤胃产气量，并且在沙葱黄酮类化合物添加量为0.032 mg时达到最大。

瘤胃pH值的波动直接反映瘤胃发酵的变化以及微生物的活动。当反刍动物采食日粮后，非结构性碳水化合物在瘤胃内迅速发酵产生的有机酸导致瘤胃pH值下降。瘤胃的pH值比较稳定，通常在5.5～7.5之间变化。已知pH值为6.2～6.8时，瘤胃微生物发酵纤维物质的活性最高；pH值为5.5～6.0时，瘤胃微生物发酵淀粉的活性最强；当瘤胃pH值降低到5.5以下时，原虫的生长就会受阻，动物出现酸中毒[9]。赵春艳[10]研究报道，饲喂沙葱组的肉羊瘤胃内环境中BCP、VFA及pH值显著高于对照组，而NH3-N的浓度显著降低。本试验结果发现，添加沙葱黄酮类化合物显著提高培养后期的瘤胃pH值，并且pH值均在正常范围之内，以0.032 mg和0.042 mg添加组对pH值的影响较大，这说明沙葱黄酮类化合物能够有效促进瘤胃pH值。

瘤胃内氨的最主要去路是瘤胃微生物的摄取，NH3-N是纤维素分解菌的必需氮源，也是非纤维素分解菌的部分氮源。因此NH3-N浓度综合反映了瘤胃微生物分解含氮物质产生NH3-N的速度及其对NH3-N的摄取利用情况，是直接反映瘤胃微生物活力的重要指标，也是影响微生物蛋白合成效率的重要因素[11]。瘤胃液中微生物生长最佳NH3-N浓度为6.3～27.5 mg/100 ml[12]。研究表明，体外培养条件下，瘤胃微生物生长的最佳NH3-N浓度为5～8 mg/100 ml，体内条件下为：7～9 mg/100 ml[13]。本研究结果表明，添加0.032 mg和0.042 mg沙葱黄酮类化合物显著降低培养液中NH3-N浓度，并NH3-N浓度均处于最佳范围之内，可能是日粮中添加沙葱黄酮类化合物，使得瘤胃中可降解蛋白减少，导致NH3-N浓度降低。也有可能是沙葱黄酮类化合物刺激瘤胃微生物菌群摄取NH3-N并合成蛋白质引起的。

微生物菌体蛋白是反刍动物最主要的氮源供应者，能够提供其蛋白需要的40%～80%。微生物生长最主要的营养物质是蛋白质和碳水化合物，并需要包括维生素、常量元素和微量元素等营养物质的辅助，会受到反刍动物瘤胃pH值和NH3-N浓度的直接影响。BCP浓度可以间接反映培养体系中微生物种群的数量以及微生物利用NH3-N的能力。赵国芬[14]研究发现，在绵羊日粮中添加4%鲜沙葱，可显著提高瘤胃BCP浓度。从本试验结果看，日粮中添加小剂量（0.042 mg/2 g）的沙葱黄酮类化合物同样可以提高培养液中的BCP浓度，这说明沙葱黄酮类化合物能够有效促进瘤胃微生物的增殖。

VFA是饲料碳水化合物消化代谢的最终产物，也是绵羊最主要的能量来源，主要参与瘤胃微生物的合成提供能量。其中乙酸、丙酸、丁酸是VFA的主要成分，它们的浓度大小直接反映发酵类型和吸收情况。研究表明，瘤胃内发酵所产生的VFA可为反刍动物机体提供70%～80%所需能量[15]。本试验结果显示，沙葱黄酮类化合物显著提高瘤胃VFA浓度（0.052 mg/2 g除外）。

添加沙葱黄酮类化合物使体外发酵产气量、pH值升高。降低瘤胃NH3-N浓度，增加瘤胃的BCP浓度，有利用于反刍动物的微生物氮的增加，减少反刍动物对蛋白质的维持需要；从总体上看来，沙葱黄酮类化合物能够促进瘤胃发酵，优化瘤胃内环境。

4 结论

在体外精粗比为30∶70日粮条件下，与对照组相比，0.032 mg沙葱黄酮类化合物添加组显著提高绵羊瘤胃产气量、pH值(19～24 h)、VFA浓度，显著降低NH3-N浓度；0.042 mg沙葱黄酮类化合物添加组显著提高绵羊瘤胃pH值(19～24 h)、BCP浓度，显著降低NH3-N浓度。综合影响瘤胃发酵水平来推测沙葱黄酮类化合物在日粮中最适的添加范围为0.032～0.042 mg/2 g，即16～21 mg/kg。