紫地榆两种不同溶剂萃取物对变异链球菌的体外实验

2015-01-18杨淋，蓝海

中成药 2015年8期

关键词：产酸乙酸乙酯链球菌

杨淋，蓝海

（大理大学药学与化学学院，云南大理671000）

紫地榆两种不同溶剂萃取物对变异链球菌的体外实验

杨淋，蓝海*

（大理大学药学与化学学院，云南大理671000）

目的研究紫地榆粗提物乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌生长、产酸及黏附的影响。方法首先测定紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌最低抑菌浓度（MIC），选择大于MIC的浓度测定其对变异链球菌最低杀菌浓度（MBC），再以低于MIC的4个浓度配制含药的TPY液体培养基测定紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌产酸、黏附的影响。结果紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌的生长、产酸及黏附有一定的抑制作用。结论上述结果提示，紫地榆有可能是一种潜在的天然防龋药物，值得进行更深入的研究。

紫地榆；萃取物；变异链球菌；最低抑菌浓度；最低杀菌浓度；产酸；黏附

龋病是人类继心血管疾病和癌症之后的第三种需要重点防治的疾病，全球60%～90%的儿童和成人都因龋病而困扰。2010年，全球有超过50亿的人患过龋病［1］。目前，我国的龋病发病率高达70%～80%，在婴幼儿中高达90%以上，龋病防治工作迫在眉睫。变异链球菌是口腔中的主要常驻菌之一，是龋病的主要致病菌，已被公认为口腔的主要致龋菌［2］。本研究探讨紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌生长、产酸及黏附的影响，为了解该药物在龋病防治中的作用提供参考。

1 材料

紫地榆（产地云南，大理大学生药教研室杨月娥高级实验师鉴定为紫地榆），变异链球菌ATCC 25175（广东微生物菌种保藏中心），胰酶解酪蛋白-植物蛋白胨-酵母提取物（trypticase-phytone-yeast extract medium，TPY）固体及液体培养基，0.5、0.1 mo1/L氢氧化钠，0.5 mo1/L磷酸盐（PBS）缓冲液，蔗糖，无水乙醇，葡萄糖，蒽酮，石油醚，三氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇。以上试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 紫地榆粗提物的制备将原药材粉碎，用95%乙醇常温浸泡24 h，把滤液旋转蒸发成浸膏后加适量蒸馏水溶解，用石油醚，三氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇，蒸馏水萃取，所得的各部分冷冻干燥后得粉末备用。石油醚部分的相对生药得率很小（小于0.1%），三氯甲烷部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分的相对生药得率分别为0.192 7%～0.308 4%、8.017 2%～9.456 9%、9.048 1%～11.323 3%、2.341 1%～3.198 3%。

2.2 菌液制备将复苏48 h后的变异链球菌，接种于TPY液体培养基中，在37℃、80%N2，20%CO2、厌氧条件下培养18 h。经生化鉴定及涂片检查为纯培养后，将细菌在TPY固体培养基上传代，用无菌棉签取TPY固体培养基上的二代菌落于无菌生理盐水内，将菌液调至相当于0.5号麦氏标准比浊管的浓度，配成630 nm波长处菌液浓度光密度值（optica1 density，OD值）约为0.1的菌悬液，备用。

2.3 MIC及MBC的测定将紫地榆乙酸乙酯部分和水部分分别按2倍稀释法溶于含1%葡萄糖的TPY液体培养基中，使其终质量浓度分别为72.00、36.00、18.00、9.00、4.500、2.250、1.125、0.563 0 mg/mL。将菌悬液与含药液的培养基按1∶1（V/V）比例，加入96孔板后置37℃，80%N2，20%CO2厌氧条件下培养48 h，以肉眼观察无细菌生长的最低药物质量浓度为其MIC值。选择大于MIC浓度的各孔，分别取20μL涂布于TPY固体培养基上，相同条件下培养48 h，观察菌落数少于5～6个的最低浓度为最低杀菌浓度（MBC）［3］，实验重复3次。

2.4 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌产酸作用的影响根据紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对上述变异链球菌的MIC测定结果，选取MIC值以下4个浓度梯度配制成含1%葡萄糖的TPY液体培养基，调定初始pH为7.4并按菌液与TPY液体培养基比例为1∶10（V/V）比例接种此菌，置37℃，80%N2，20%CO2下厌氧培养48 h。用ORION 710A型pH计测定培养物上清液的pH值计算pH的变化值△pH（初始pH-终末pH）。以不含药物的培养基中细菌的产酸量作为阴性对照，以含0.05%洗必泰的培养基中细菌的产酸量作为阳性对照，实验共分6组，即4个不同浓度的实验组、1个阳性对照组、1个阴性对照组，每组设3个平行管，实验重复3次。

2.5 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌黏附作用的影响采用2倍稀释法将含5%蔗糖和含紫地榆乙酸乙酯部分、水部分的TPY液体培养基配成MIC以下4个浓度梯度的实验组，另设1个不含药液的阴性对照组，一个含0.05%洗必泰的阳性对照，每组3个平行管。将菌悬液与药液按体积比1∶10接种，各试管混匀，置管与地平面呈30°，置37℃，80%N2，20%CO2下厌氧培养48 h。将试管中液体轻轻移去，将黏附到试管壁的细菌用磷酸盐缓冲液洗脱，每次3 mL，共计3次，然后3 000 r/min离心20 m in，收集细菌置于2 mL蒸馏水中混匀。各试管均吸取200μL于96孔板，用酶标仪测定630 nm波长处OD值，重复测3次，结果取平均值，并计算黏附抑制率。

黏附抑制率=（阴性对照组OD630nm-实验组OD630nm）/阴性对照组OD630nm×100%

2.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件，数据变量资料用（）表示，检验水准α=0.05，各组总体均数之间比较采用单因素方差分析（ANOV，Ana1ysis of variance）；两两比较用Dunnett T3检验。

3 结果

3.1 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌生长的影响紫地榆乙酸乙酯部分对变异链球菌的MIC和MBC分别为4.500 mg/mL，72.00 mg/mL。

紫地榆水部分对变异链球菌的MIC和MBC分别为18.00 mg/mL，288.0 mg/mL。

3.2 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌产酸作用的影响紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变形链球菌产酸作用的影响见表1和图1。

随着紫地榆乙酸乙酯部分质量浓度的升高，△pH值越来越小。经单因素方差分析，各浓度组△pH值总体均数不全相等（F=3290.116，P＜0.01），经Dunnett T3检验各实验组的△pH值与阴性对照组和阳性对照组相比，均具有统计学差异（P＜0.05）；4个实验组间，任意两组间均具有统计学差异（P＜0.05）。

随紫地榆水部分质量浓度的增加，△pH值的变化不明显。经单因素方差分析，各浓度组△pH值总体均数不全相等（F=3501.803，P＜0.01），经Dunnett T3检验，各实验的△pH值与阴性对照组和阳性对照组相比，均具有统计学差异（P＜0.05）；4个实验组间，任意两组间均不具有统计学差异（P≥0.05）。

表1 不同浓度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌产酸作用的影响（，n=9）

注：与阴性照组比较，aP＜0.05；与阳性照组比较，bP＜0.05；任意两实验组比较，cP＜0.05

乙酸乙酯部分水部分质量浓度/（mg·m L-1） △pH值质量浓度/（mg·mL-1） △pH值2.250 0.866 4±0.028 8a，b，c 9.00 0.640 6±0.036 9a，b0.731 7±0.081 6 1.125 0.971 7±0.032 9a，b，c 4.500 0.6403±0.049 1a，b0.563 0 2.635 8±0.280 7a，b，c 2.250 0.666 4±0.057 6a，b0.281 0 3.263 6±0.175 6a，b，c 1.125 0.681 4±0.073 1a，b阴性对照组 3.549 4±0.045 2 阴性对照组 2.629 7±0.147 8阳性对照组 0.745 1±0.075 2 阳性对照组

图1 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物对变异链球菌产酸的影响

3.3 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌黏附作用的影响紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变形链球菌黏附的影响见图2和表2。

随着紫地榆乙酸乙酯部分质量浓度的升高，黏附抑制率也随之增高。经单因素方差分析，各浓度组△pH值总体均数不全相等（F=342.213，P＜0.01），经Dunnett T3检验，各浓度组OD值与阴性对照组和阳性对照组相比，均具有统计学差异（P＜0.05）；4个实验组间，除0.563 0 mg/m L与0.281 0 mg/mL比较不具有统计学差异外，其他任意两组比较均具有统计学差异（P＜0.05）。

随着紫地榆水部分质量浓度的升高，黏附抑制率也随之增高。经单因素方差分析，各浓度组△pH值总体均数不全相等（F=754.271，P＜0.01），经Dunnett T3检验，各浓度组OD值与阴性对照组和阳性对照组相比，均具有统计学差异（P＜0.05）。4个实验组间，除9.00 mg/mL与4.500 mg/mL比较不具有统计学差异，其他任意两组比较均具有统计学差异（P＜0.05）。

图2 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物对变异链球菌黏附的影响

表2 不同质量浓度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对变异链球菌黏附作用的影响（，n=9）

注：与阴性照组比较，aP＜0.05；与阳性照组比较，bP＜0.05；任意两实验组比较，cP＜0.05

水部分质量浓度/（mg·mL-1） OD值黏附抑制率/% 质量浓度/（mg·mL-1） OD值黏附抑制率/% 2.250 0.195 7±0.060 9a，b，c 64.98 9.00 0.277 4±0.022 8a，b乙酸乙酯部分0.043 4±0.004 5 92.23 62.23 1.125 0.246 3±0.039 6a，b，c 55.93 4.500 0.293 3±0.033 8a，b 59.95 0.563 0 0.286 3±0.044 0a，b 48.96 2.250 0.354 1±0.068 6a，b，c 51.60 0.2810 0.317 4±0.034 9a，b 43.20 1.125 0.491 5±0.056 4a，b，c 33.09阴性对照组 0.558 8±0.060 0 - 阴性对照组 0.736 9±0.048 3 -阳性对照组 0.043 4±0.004 5 92.23 阳性对照组

4 讨论

紫地榆是栊牛儿苗科老鹳草属植物Geranium trictipes R.Kunth的根，民间称隔山消。具有显著的消炎、止血、止痢功能，用于肠炎，痢疾，消化不良，慢性胃炎，月经不调，鼻衄；外用治跌打损伤［4-6］。张娴文［7］、洪小凤［8］等通过紫地榆的体外抗菌实验证实紫地榆提取物具有良好的体外抗菌作用，其主要的化学成分有［9-10］：没食子酸、鞣花酸、原儿茶酸、五倍子酸甲酯、（+）-儿茶素、3，4-二羟基苯甲酸等。

变异链球菌的致龋毒力因子主要是对牙面的产酸、黏附、生成水不溶性胞外多糖。在成熟菌斑深层的缺氧环境中变异链球菌主要通过糖酵解途径分解糖而代谢产酸，从而使局部pH下降，造成牙体硬组织酸蚀脱矿、有机物分解，进而导致龋病的形成和发展［11］。本实验测定紫地榆乙酸乙酯部分与变异链球菌共同培养48 h后的pH变化发现，0.563 0～2.250 mg/mL不同质量浓度的紫地榆乙酸乙酯部分和1.125～9.00 mg/mL不同质量浓度的紫地榆水部分对变异链球菌培养上清液的pH下降均具有明显影响（P＜0.05），提示紫地榆乙酸乙酯部分和水部分能抑制变异链球菌的产酸。

变异链球菌在牙面上黏附和定植是龋病发生的始动因子。实验结果显示，0.563 0～2.250 mg/mL不同质量浓度的紫地榆乙酸乙酯部分和1.125～9.00 mg/mL不同质量浓度的紫地榆水部分均能明显抑制变异链球菌的黏附能力（P＜0.05）；且其抑制作用随着紫地榆乙酸乙酯部分质量浓度和紫地榆水部分质量浓度的增加而明显增强，提示紫地榆乙酸乙酯部分和水部分能有效抑制变异链球菌的黏附能力。本实验所示的变异链球菌的产酸量和黏附率均是用OD值约为1的同一菌悬液实验的结果。变异链球菌的产酸量和黏附率与紫地榆萃取物抑制或杀伤变异链球菌的菌量呈负相关，即药物质量浓度越高，抑制或杀伤变异链球菌的菌量越多，故其产酸量和黏附率越低。

醋酸洗必泰又称醋酸氯己定（ch1orhexidine acetate，CA）是阳离子表面活性剂，对细菌有良好的亲和力，能结合到细菌的细胞膜表面，改变膜的渗透性，造成细胞内物质流出、细胞浆沉淀和凝集，从而杀灭细胞。刘建宁等［12］研究证实，洗必泰漱口液可以有效地控制菌斑，减轻牙龈炎的程度。本实验结果显示，紫地榆水部分抑制变异链球菌产酸的能力比0.05%的洗必泰强，且具有显著性差异（P＜0.05）；紫地榆乙酸乙酯部分抑制变异链球菌产酸的能力比0.05%的洗必泰弱，且显著性差异较明显（P＜0.05）；紫地榆乙酸乙酯部分和水部分抑制变异链球菌黏附的能力均比0.05%的洗必泰弱，可能因为0.05%的洗必泰抗菌作用强，在短时间内细菌被杀死。天然植物的抑菌作用可能不及化学试剂洗必泰，但长期使用洗必泰会有牙齿变色、味觉障碍等副作用，因此本研究为寻找副作用较轻的天然防龋药物打下基础。

综上所述，紫地榆乙酸乙酯部分和水部分可抑制变异链球菌的产酸、黏附的作用，具有抗菌斑、预防龋病的潜力。本研究为紫地榆乙酸乙酯部分在口腔防龋方面的应用做出初步探索，而其药物有效成分、防龋具体机制的研究还有待于进一步深入。

致谢:大理大学病原微生物学综合实验室提供支持！

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