高 莉， 彭晓明， 霍仕霞， 何 燕， 闫 明

（新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所新疆维吾尔医方剂学重点实验室，新疆乌鲁木齐830049）

类叶升麻苷对缺糖缺氧诱导PC12细胞损伤的保护作用

高 莉， 彭晓明， 霍仕霞， 何 燕， 闫 明*

（新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所新疆维吾尔医方剂学重点实验室，新疆乌鲁木齐830049）

目的观察类叶升麻苷对连二亚硫酸钠致PC12细胞缺糖缺氧损伤的保护作用。方法以1 mmo1/L连二亚硫酸钠诱导PC12细胞建立缺糖缺氧损伤模型，然后以0.1、1、10、100μmo1/L的类叶升麻苷拮抗其作用。倒置显微镜观察PC12细胞形态学变化，MTT比色法测定细胞存活率，化学比色法测定细胞内乙酰胆碱 （Ach）水平、乙酰胆碱转移酶（ChAT）及乙酰胆碱酯酶（TChE）活性。结果采用缺糖缺氧损伤PC12细胞后，Ach水平、ChAT活力均降低；与不同浓度的类叶升麻苷 （0.1、1、10、100μmo1/L）共孵育24 h后，各类叶升麻苷给药组均可提高Ach水平及ChAT活力，而TChE活力无明显变化。结论类叶升麻苷对连二亚硫酸钠联合无糖培养液造成PC12细胞缺糖缺氧损伤具有显著的保护作用，其机制可能与提高ChAT活性进而增加Ach水平有关。

类叶升麻苷；PC12细胞；连二亚硫酸钠；乙酰胆碱酯酶

血管性痴呆（vascu1ar dementia，VD）是由一系列缺血性脑血管疾病所导致的认知功能障碍综合征，在我国血管性痴呆占各类痴呆发病的第一位。脑组织代谢旺盛，血流量丰富，因此极易受到缺血的影响，引起神经细胞功能的损害［1］。类叶升麻苷 （acteoside）是肉苁蓉的主要有效成分，且含有量较高，经药理研究发现，其具有神经保护、调节免疫、增强记忆力、抗肿瘤等生物活性，有较为广阔的开发前景［2］。

本实验室前期实验结果提示类叶升麻苷对动物认知功能障碍有一定的改善作用，其机制可能与抗自由基生成和改善胆碱系统功能有关［3］。另外，也有学者研究证实类叶升麻苷对胆碱能系统产生影响［4］。虽然，目前有报道显示类叶升麻苷具有保护神经细胞的作用［5-6］，但类叶升麻苷对缺糖缺氧（oxygen-g1ucose deficiency，OGD）细胞模型的作用未见相关报道。因此，为了进一步探讨类叶升麻苷对神经细胞保护的机制，本实验利用体外培养PC12细胞缺糖缺氧实验模拟体内的缺血状态，研究类叶升麻苷对连二亚硫酸钠 （Na2S2O4）所致PC12细胞缺糖缺氧模型中胆碱系统的影响，以乙酰胆碱（acety1cho1ine，Ach）水平、乙酰胆碱转移酶（cho1ine acety1transferase，ChAT）活力及乙酰胆碱酯酶（acety1cho1inesterase，AchE）活力为指标，探讨类叶升麻苷增强学习记忆的机制。

1 实验材料

1.1 药物 类叶升麻苷分子质量为624.59，由新疆维吾尔医药研究所新疆维吾尔医方剂学重点实验室提供，其化学结构经核磁共振波谱法和质谱法确认，高效液相色谱（HPLC）面积归一化法鉴定其纯度为95%。

1.2 细胞株 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞购自中国科学院细胞库。

1.3 实验试剂与仪器 胎牛血清（Hyc1one产品）；完全RPMI1640培养液（Gibco产品）；无糖RPMI1640培养液（Gibco产品）；氨苄青霉素钠和硫酸链霉素（Amersco公司）；连二亚硫酸钠（天津市福晨化学试剂厂，20100710）；四甲基偶氮唑蓝 （美国Amresco公司）；二甲基亚砜 （天津市光复化工研究所）；乙酰胆碱 （ACh）测定试剂盒 （20130923）、乙酰胆碱转移酶 （ChAT）测试盒（20130923）、乙酰胆碱酯酶 （TChE）测试盒 （20130923）、BCA法蛋白定量测试盒 （20130918）均购自南京建成生物技术研究所。

1.4 实验仪器 净化工作台（苏净，SW-CJ-1F）；CO2培养箱（日本SANYO公司MCO-18AIC型）；倒置光学显微镜（上海光学六厂，37XB）；全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific 1510型）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 PC12细胞用含10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，置37℃、5%CO2孵箱中，2～3 d换液1次，3～4 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 PC12细胞OGD模型的建立及给药［7］实验设正常组、模型组和类叶升麻苷治疗组。各组处理如下，模型组：根据文献［8］方法加入1 mmo1/L的Na2S2O4处理细胞2 h，建立缺糖缺氧细胞模型；类叶升麻苷治疗组：根据前期药物浓度筛选选取0.1、1、10、100μmo1/L的类叶升麻苷与Na2S2O4处理细胞2 h后的细胞共孵育24 h；正常组则只加入等体积的RPMI1640培养基。

2.3 四甲基偶氮唑蓝 （MTT）检测细胞存活数［9］取对数生长期的PC12细胞，细胞计数为3×104个/m L均匀的铺于96孔板，100μL/孔，于培养箱中培养48 h后用1 mmo1/L Na2S2O4造模，3 h后按分组要求予以不同处理，培养48 h后每孔加终质量浓度为5 mg/mL MTT反应4 h后，吸去上清 （注意避免吸走甲瓒结晶），每孔加入200 μL DMSO，振荡待孔内结晶完全溶解后于490 nm处测OD值。

2.4 乙酰胆碱相关指标测定 取对数生长期的PC12细胞，细胞计数为5×104个/mL铺48孔板，200μL/孔，于培养箱中培养48 h后用1 mmo1/L Na2S2O4造模300μL/孔，3 h后按分组要求予以不同处理，培养48 h后，取每孔培养液和细胞悬液按照试剂盒说明书分别测定乙酰胆碱 （Ach）水平、乙酰胆碱转移酶 （ChAT）活力、乙酰胆碱酯酶（TChE）活力。

3 统计学方法

4 结果

4.1 类叶升麻苷对缺糖缺氧损伤PC12细胞形态的影响

细胞形态观察可见，正常组细胞为多角形贴壁细胞，树突明显，折光度强，细胞数量多，而模型组用1 mmo1/L Na2S2O4损伤，细胞数减少，树突回缩，且折光度减弱。模型中PC12细胞的损伤及药物保护的形态学表现基本一致，但随着加药浓度的不同，各给药组细胞损伤程度减轻，呈现一定的药物保护形态，与模型组相比，细胞树突增多且有聚集的现象。见图1。

4.2 对细胞存活率的影响 PC12细胞用1 mmo1/L Na2S2O4造模3 h后，其抑制率达到35.9%，与正常组相比具有统计学意义 （P＜0.01），表明造模条件可靠，造模成功。各个给药组与模型组相比，亦可见给药组细胞存活率增加，即类叶升麻苷可抑制Na2S2O4对PC12细胞所致的缺糖缺氧损伤，在1～100μmo1/L范围内，随着给药浓度的升高，保护作用越强，且存在浓度依赖关系。见图2。

图2 类叶升麻苷对PC12细胞OGD模型存活率的影响（，n=6）

4.3 乙酰胆碱相关指标的测定 实验结果表明，1 mmo1/L Na2S2O4能引起PC12细胞Ach水平、ChAT活力及ChAT/ TChE比值均降低 （P＜0.01，P＜0.05）；与不同浓度类叶升麻苷共孵育后，四组类叶升麻苷剂量均可显著提高Ach水平及ChAT活力（P＜0.01），对TChE活力无明显影响，而ChAT/TChE比值逐渐升高。见表1。

表1 类叶升麻苷对Na2S2O4所致PC12细胞Ach以及ChAT、TChE的影响（，n=6）

表1 类叶升麻苷对Na2S2O4所致PC12细胞Ach以及ChAT、TChE的影响（，n=6）

注：与正常组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，##P＜0.01

ChAT/TChE正常组组别 剂量/（μmo1·L-1）Ach/（μg·mgprot-1）ChAT/（μg·mgprot-1）TChE/（μg·mgprot-1）10.8±0.35 0.77±0.09 1.48±0.39 0.54±0.11模型组 6.11±0.87** 0.23±0.03** 1.07±0.02 0.21±0.01*类叶升麻苷 0.1 13.49±1.5## 0.53±0.09## 1.59±0.21 0.34±0.08类叶升麻苷 1 8.84±0.98## 0.58±0.08## 1.59±0.31 0.37±0.09类叶升麻苷 10 10.26±2.05 0.63±0.17## 1.6±0.38 0.48±0.03##类叶升麻苷 100 12.57±0.51## 0.71±0.01## 1.03±0.09 0.69±0.06##

5 讨论

PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆的细胞株，细胞膜上有胆碱能M、N受体等，已广泛用作研究神经细胞分化、离子通道、受体的实验材料［1］，缺糖缺氧损伤PC12模型作为一种快速、敏感的体外中枢神经缺血模型是目前较为公认的研究脑缺血模型，常用于评价药物潜在的神经保护作用［7］。

神经元损伤和死亡是由供血不足、营养物质 （葡萄糖）缺乏及代谢物的累积所导致的［8-9］。神经元缺氧导致糖、蛋白质、脂质代谢障碍，产生内源性细胞毒素，最终使细胞死亡。近年来［10］，人们对血管性痴呆的发病机制进行了大量的研究，越来越多的证据表明胆碱能系统参与了血管性痴呆的发生。血管性痴呆发生时中枢胆碱能系统受损，其认知损害机制涉及胆碱能递质及其受体等方面的改变。而且临床实验研究已证明，胆碱能治疗策略血管性痴呆有效［11-12］。贾建平等［13］学者的临床研究发现，血管性痴呆患者脑脊液 （CSF）中Ach水平较对照组显著降低，且下降幅度与痴呆程度成正关。众所周知，Ach是中枢神经系统内神经细胞突触传递过程中的一种关键性神经递质，它由 ChAT催化合成，TChE催化分解［14］，其ChAT/AchE比值显著影响Ach的表达水平［15］，所以本实验选用乙酰胆碱水平、乙酰胆碱转移酶活力及乙酰胆碱酯酶活力为测试指标，研究类叶升麻苷对OGD模型的保护作用。

本实验采用Na2S2O4结合无糖培养液模拟脑缺血损伤神经的状态，进行研究类叶升麻苷对离体的缺糖缺氧细胞模型的保护作用。MTT是广泛地用于检测细胞存活和增殖的指标，它可以敏感的测量细胞代谢状态。实验中显示，1 mmo1/L Na2S2O4可引起PC12数量减少，树突回缩，其生存能力显著下降，与0.1～100μmo1/L不同剂量类叶升麻苷共孵育后均能显著增强细胞存活率，且呈现剂量依赖性。以上结果表明，类叶升麻苷在0.1μmo1/L剂量下即可明显抑制 （P＜0.01）缺糖缺氧对细胞的损伤作用，能够保护PC12细胞在体外受到的缺糖缺氧诱导损伤，对缺血造成的神经损伤具有潜在保护性作用。另外，实验中未观察到类叶升麻苷对PC12细胞的毒性。

进一步对Ach水平以及ChAT、TChE活性检测发现，PC12细胞经缺糖缺氧诱导损伤后，细胞内 Ach水平、ChAT活性明显下降以及ChAT/TChE比值显著下降（P＜0.05），提示Na2S2O4可能通过降低ChAT活力以及ChAT/ TChE比值 （P＜0.01），从而降低Ach水平。与不同剂量类叶升麻苷共孵育24 h后，各组的细胞内Ach水平、ChAT活性以及ChAT/TChE比值均明显不同程度的增高，在1～100μmo1/L剂量下随着类叶升麻苷浓度升高，Ach水平和ChAT活性随剂量逐步升高，TChE则无明显变化。这些结果表明，类叶升麻苷能够通过升高ChAT活力以及ChAT/ TChE比值，促进Ach合成增加，增强Ach的神经递质传导作用，从而保护OGD诱导的PC12细胞细胞损伤，且呈现一定的剂量依赖性。

综上所述，类叶升麻苷可改善PC12细胞形态，显著提高细胞存活率，对Na2S2O4所致的PC12细胞损伤有显著保护作用；其保护作用可能与升高ChAT活力以及ChAT/ TChE活力比值，从而增高Ach水平有关，表明类叶升麻苷具有开发应用于预防和治疗脑缺血类血管性痴呆以及脑中风后遗症等药物的潜能。

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R966

B

1001-1528（2015）08-1821-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.042

2015-05-20

新疆维吾尔自治区科技支疆项目 （201491174）

高 莉（1980—），女，博士，副研究员，主要从事中药新药筛选研究。E-mai1：gao1i-535@163.com

*通信作者：闫 明（1959—），男，硕士，研究员，主要从事创新药研究。E-mai1：yanming21cn@sohu.com