尉广飞， 李 翠， 刘 谦， 李 佳， 张永清

（山东中医药大学，山东济南250355）

丹参根部直径与其活性成分含有量间的相关性研究

尉广飞， 李 翠， 刘 谦， 李 佳， 张永清*

（山东中医药大学，山东济南250355）

目的探讨丹参根部直径大小与其活性成分含有量间的相关性。方法HPLC法测定4个平均直径 （1.366、1.085、0.808和0.360 cm）丹参根中的脂溶性成分 （隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA）和水溶性成分 （丹酚酸B和迷迭香酸）含有量，然后进行统计分析。结果直径最小的丹参根中迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ和隐丹参酮的含有量分别是直径最大的150%、193.71%、533.33%，200%和377.78%。结论丹参加工时不应将细条及须根丢弃。

丹参；根；直径；隐丹参酮；丹参酮Ⅰ；丹参酮ⅡA；丹酚酸B；迷迭香酸；相关性

丹参Salvia miltiorrhiz a Bge为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，具有重要的药用价值，其干燥根及根茎即为传统中药丹参，可祛瘀止痛、活血通经、清心除烦，用于治疗月经不调、经闭痛经、症瘕积聚、胸腹刺痛、热痹疼痛、疮疡肿痛、心烦不眠等病症。现代研究证明，其活性成分分为两大类，一是水溶性成分，包括丹参素、原儿茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸D和丹酚酸E等；二是脂溶性成分，包括隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA等，具有抗心律失常、保护血管内皮细胞、减轻缺血再灌注损伤、抗动脉粥样硬化、保肝及抗肝纤维化等药理活性［1］。由于丹参药材市场需求量非常大，目前主要依靠人工栽培以满足需要，在河南、山东、陕西、河北等省区均有大面积种植。传统经验认为，丹参药材 “以条粗、内紫黑色，有菊花状白点者为佳”，生产中常常将细条及须根丢弃。究竟丹参药材条粗好，还是条细好，这不仅影响丹参良种选育目标的确定，也影响施肥、浇水等具体栽培措施的进行，亟需予以解决，但有关丹参药材研究目前多集中在种质［2］、产地［3-4］、加工贮藏［5-6］等方面。刘先琼等［7］分析了不同直径丹参中丹参酮ⅡA的含有量，发现直径越小，丹参酮ⅡA含有量越高，但未考察水溶性成分含有量是否与丹参直径有关。本实验根据根部直径，将丹参药材分为不同的类别，分别测定了脂溶性和水溶性两大类成分，以期为丹参药材合理分级及规范化种植标准的制定提供理论依据。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料 2013年10月20日收集河南省灵宝市阳店镇羊角寨村药材基地种植的丹参植株，系2012年8月育苗，2013年春季移栽植株，尽量保持根段不折断，收刨面积为500 m2，截取长30 cm根段，测定其最粗部位直径。然后，根据直径大小，将丹参根段分为4个级别。1级，直径最大，平均直径为1.366 cm；2级，直径较大，平均直径为1.085 cm；3级，直径较小，平均直径为0.808 cm；4级，直径最小，平均直径为0.360 cm，统一晒干 （保持干燥条件一致）。在干燥后的各级别丹参根段中，随机抽取20支，粉碎，置干燥器中备用，各级别平行实验3次。所用药材经山东中医药大学周凤琴教授鉴定，确认为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根部。

1.2 仪器 Ag1ient 1260高效液相色谱仪，包括G1311C四元高压梯度泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D二极管阵列检测器、Chem Station色谱数据工作站（美国Ag1ient公司）；CP225D型精密电子天平 （上海精密科学仪器有限公司）；KQ-500DE型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）；高速多功能粉碎机 （25 000 r/min，上海树立仪器仪表有限公司）；数显式电热恒温干燥箱（上海阳光实验设备有限公司）。

1.3 试剂 迷迭香酸 （批号20120809）、丹酚酸B（批号 PA0418RA13）、丹参酮ⅡA（批号20130111），购自上海源叶生物科技有限公司；丹参酮Ⅰ （批号110867-200406）和隐丹参酮 （批号110852-200806），购自中国食品药品检定研究院。甲醇 （分析纯）、磷酸 （优级纯）、乙腈 （优级纯），购自国药集团化学试剂有限公司；纯净水，购自杭州娃哈哈集团有限公司。

2 方法

2.1 对照品溶液制备 分别精密称取减压干燥至恒定质量的脂溶性对照品丹参酮ⅡA 0.93 mg、丹参酮Ⅰ0.94 mg、隐丹参酮1.07 mg，置于50 mL棕色量瓶中，甲醇溶解后定容，然后稀释10倍，质量浓度分别为1.86、1.88、2.74μg/m L。再分别精密称取水溶性对照品迷迭香酸0.2 mg和丹酚酸B 2.12 mg，置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解后定容，质量浓度分别为20和212μg/mL，即得。

2.2 样品溶液制备

2.2.1 水溶性成分 准确称取丹参粉末0.5 g，置于磨口锥形瓶中，加入75%甲醇50 m L，50℃下超声提取40 min，取出放冷，用75%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，续滤液用微孔滤膜 （0.45 μm）滤过，即得。

2.2.2 脂溶性成分 准确称取丹参粉末0.5 g，置于磨口锥形瓶中，加入甲醇50mL，50℃下超声提取40 min，取出放冷，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，续滤液用微孔滤膜 （0.45μm）滤过，即得。

2.3 色谱条件

2.3.1 水溶性成分 Diamonsi1 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱温30℃；波长286 nm；体积流量1.0 mL/min；进样量10μL；流动相A为乙腈，流动相B为0.026%磷酸水溶液，梯度洗脱（0～15 min，17%～23%A；15～30 min，23%～25%A；30～40 min，25%～90%A；40～50 min，90%A）。理论塔板数按丹酚酸B计，不低于3 000。

2.3.2 脂溶性成分 Diamonsi1 C18色谱柱（4.6 mm×250mm，5μm）；柱温25℃；波长270 nm；体积流量1.0 mL/min；进样量10μL；流动相A为乙腈，流动相B为0.026%磷酸水溶液，梯度洗脱 （0～20min，20%～60%A；20～50 min，60%～80% A）。理论塔板数按丹参酮ⅡA计，不低于3 000。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系 按照 “2.1”项下方法，配制不同质量浓度的各对照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，以对照品标准溶液进样量为横坐标 （X），峰面积为纵坐标 （Y）进行线性回归，结果见表1。

表1 丹参各活性成分对照品回归方程Tab.1 Regression equation of each active ingredient reference substance of Danshen

2.4.2 精密度试验 取同一供试品溶液适量，连续进样6次，每次10μL，测定迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的峰面积。结果，RSD值均小于1.5%，说明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 将同一供试品溶液在室温下放置，分别于0、2、6、12、18、24 h后各进样1次，每次10μL。结果，迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积的RSD值均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一批丹参样品6份，按上述供试液的制备方法制备样品，按选定的色谱条件测定，计算迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含有量。结果，RSD值均小于2.0%，表明重复性良好。

2.4.5 回收率试验 精密称定各成分含有量已知的1级丹参根段粉末样品0.5 g，加入对照品溶液，按 “2.2”项方法制备样品溶液，测定结果见表2，表明回收率良好。

表2 加样回收试验结果Tab.2 Results of recovery tests

3 结果与分析

3.1 不同直径丹参水溶性活性成分 分别精密吸取对照品与供试品水溶性溶液10μL，在 “2.3.1”项色谱条件下进行分析，丹参水溶性成分混合对照品及其样品的HPLC色谱图如图1所示。

图1 丹参水溶性成分混合对照品和样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of water-solublem ixed reference substances and sam p le of Danshen

然后，测定各吸收峰峰面积，外标法计算水溶性成分迷迭香酸和丹酚酸B的含有量，测定结果见图2，二者总含有量的测定结果见图3。

图2 不同直径丹参根部丹酚酸B和迷迭香酸的含有量Fig.2 Contents of Sal B and nosmarinic acid in Danshen roots w ith differen t diameters

图3 不同直径丹参根部水溶性成分的总含有量Fig.3 Total contents of w ater-soluble constituents in Danshen rootswith different diameters

图2、图3结果显示，丹参根部的丹酚酸B迷迭香酸含有量以直径最大的1级最低，分别为1.75%、0.06%，而直径最小的4级最大，分别达3.39%、0.09%，呈现出随根部直径增加而降低的趋势。在两种水溶性成分中，丹酚酸B含有量的变化更为明显，并且两种水溶性成分的总含有量也呈现出相同的变化趋势，1级根的总含有量为1.81%，而4级根为3.48%。

3.2 不同直径丹参根部脂溶性成分 分别精密吸取脂溶性成分对照品与供试品溶液各10μL，在“2.3.2”项色谱条件下进行分析，丹参脂溶性成分混合对照品及其样品的HPLC色谱图如图4所示。

图4 丹参脂溶性成分混合对照品和样品HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of fat-soluble m ixed reference substances and sam p le of Danshen

然后，测定各吸收峰峰面积，外标法计算脂溶性成分隐丹参酮、丹参酮Ⅰ及丹参酮ⅡA的含有量，测定结果见图5，三者总含有量的测定结果见图6。

图5 不同直径丹参样品脂溶性成分的含有量Fig.5 Contents of fat-soluble constituents in Danshen rootswith different diam ters

图6 不同直径丹参样品脂溶性成分的总含有量Fig.6 Total conten ts of fat-soluble constituen ts in Danshen rootswith different diam ters

图5和图6结果显示，丹参根部的丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ含有量均以直径最大的1级最低，直径最小的4级最高。其中，1级根中丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的含有量分别为0.09%、0.09%、0.03%，4级根中的含有量分别为0.48%、0.34%、0.06%，显示出随丹参直径增大而不断降低的趋势，其中以丹参酮ⅡA含有量变化最为明显。而且，这3种脂溶性成分的总含有量也表现出相同的变化趋势，1级根为0.21%，而4级根为0.88%。

4 讨论与小结

统计分析发现，丹参根部各种活性成分含有量与直径间均具有明显负相关，丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹酚酸B、丹参酮ⅡA的相关系数r均大于0.8，相关性较强，而迷迭香酸r在0.6～0.8之间，为中度相关。说明丹参根部直径越大，无论是脂溶性还是水溶性成分的含有量均越低，药材内在质量越差，这与 “根粗质优”的传统经验不符，从而为丹参药材质量评价与分级提供了新的依据。

植物体内次生代谢物质的形成与积累往往集中在一些特定的组织或细胞中。丹参体内的丹酚酸B、迷迭香酸、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA均属于次生物质，它们的生物合成与积累也会集中在特定的组织或细胞中，但具体部位目前尚不明确［8-12］。一般来讲，生理代谢活动越旺盛的组织或细胞次生代谢越旺盛，次生物质含有量也就越高。丹参属于多年生草本植物，其根部会通过形成层产生次生生长，向外产生韧皮部，向内产生木质部，韧皮部的代谢活动一般较木质部为强，其次生代谢物质含有量也就往往较高。不同直径丹参根部各种活性成分的含有量差异与其内部组织结构有密切关系。根部越粗，韧皮部在根中所占比例越小；根部越细，韧皮部在根中所占比例越高，这可能就是根越粗，活性成分含有量越低的原因。

丹参细根中也含有较多的活性成分，具有重要的药用价值，过去往往废弃不用，是很大的损失，同时也造成了环境污染［13］。细根虽然用于生产饮片时外观质量不高，但可作为原料用于提取丹参酮ⅡA、丹酚酸B等活性成分，从而可以节约植物资源，创造较高的经济价值。

种质不同，丹参植株根部的形态特征也有明显差异，有的主根粗大，但分支较少；有的主根不明显，侧根较多。因此，可以通过品种选育，选择根粗一般、产量较高、活性成分含有量较高的新品种，以提高活性成分收率，用于中成药生产；也可选择主根粗大及侧根较少的品种，用于饮片加工生产。

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Correlation of Danshen root diam eters and their active constituent contents

WEIGuang-fei， LICui， LIU Qian， LI Jia， ZHANG Yong-qing*

（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

AIMTo exp1ore the corre1ation between Danshen（Salvia Miltiorrhiza）root diameters and their active constituent contents.METHODSHPLCmethod was used to determine the contents of fat-so1ub1e（cryptotanshinone，tanshinoneⅠand tanshinoneⅡA）and water-so1ub1e constituents（Sa1 B and rosmarinic acid）in Tanshen roots with 4 average diameters，then the statistica1 ana1ysis wasmade.RESULTSActive constituent contents in Danshen with the sma11est root diameterswere higher than the 1argest，the contents of rosmarinic acid，Sa1B，tanshinoneⅡA，tanshinoneⅠand cryptotanshinone in the sma11est diameter were 150%，193.71%，533.33%，200%and 377.78%compared with the 1argest diameter，respective1y.CONCLUSIONWhen processing Danshen，its shreds and fibrous roots shou1d not be discarded.

Danshen（Salvia miltiorrhiza）；root；diameters；cryptotanshinone；tanshinoneⅠ；tanshinoneⅡA；Sa1B；rosmarinic acid；corre1ation

R284.1

A

1001-1528（2015）08-1780-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.032

2014-10-31

山东省科技发展计划项目 （2008GG2NS02022）；国家科技重大专项 （2012ZX09034006）

尉广飞 （1986—），女，硕士，研究方向为中药资源及其质量控制。E-mai1：874101744@qq.com

*通信作者：张永清 （1962—），男，博士，教授，博士生导师，从事中药资源及其质量控制研究。E-mai1：zyq622003@126.com