钱志瑶， 周 镁， 黄秀平， 周道堂， 覃容贵

（贵州医科大学药学院，贵州贵阳550004）

黔产宽叶缬草的RAPD分析

钱志瑶， 周 镁， 黄秀平， 周道堂， 覃容贵*

（贵州医科大学药学院，贵州贵阳550004）

目的探讨黔产宽叶缬草在分子水平上的遗传多样性。方法试剂盒法提取20份宽叶缬草样本的总DNA，扩增多态性（RAPD）技术从40个随机引物中筛选出13个，对总DNA样品进行扩增，Popgene 1.32和NTSYS 2.10e软件分析样本的Nei's、Shannon's多样性指数以及Jaccard遗传相似性系数，UPGMA法进行聚类分析。结果20份宽叶缬草样本中共扩增出102条清晰条带，其中88条具有多态性，多态率为86.27%，Nei's和Shannon's多样性指数分别为0.303 0和0.453 7，Jaccard遗传相似系数在0.411 8～0.882 4之间。另外，UPGMA聚类分析可将来自剑河县的13份样本聚为一类，江口县的7份样本聚为另一类，而且剑河地区又分为栽培与野生样本2个分支。结论黔产宽叶缬草种水平上具有较高的遗传多样性，其RAPD标记可用于遗传多样性研究，为今后开发该植物的选种与育种工作奠定基础。

宽叶缬草；RAPD；遗传多样性；聚类分析

宽叶缬草Valeriana officinalis L.var.latifolia Miq为败酱科缬草属下的一个变种，在我国主要分布在贵州、四川、云南等地区［1］。它具有镇静、抗抑郁、调血脂及抗脂质过氧化等活性，并对肾脏有保护作用，另外也可治疗胆囊结石和心脑血管系统疾病，还常用作镇静剂和香精香料，有较高的经济价值［2］。贵州是宽叶缬草产量较大的地区之一，种植面积达到50 000亩以上，已经成为当地十分重要的产业［3-5］。然而，目前黔产宽叶缬草普遍存在品种退化、产品附加值低、市场竞争力弱等问题，严重制约了相关产业的发展，为了避免该药用植物枯竭，势必要进行药材的规范化栽培种植（GAP）［6］，这不但能从遗传学角度观察引起宽叶缬草品种退化的原因，也可为其栽培种植提供理论指导。

RAPD（random amp1ified po1ymorphic DNA）全名随机扩增多态性DNA，是建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列基因组进行多态性分析的分子技术，通过使用一系列具有10个碱基的单链随机引物，可对基因组全部DNA进行PCR扩增来检测其多态性［7］。为了更好地开发利用宽叶缬草这一优良的中药资源，本实验应用该技术对其进行初步研究，为今后进行该植物的种植育种奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料 宽叶缬草大部分采自贵州省江口苗药生物科技有限公司剑河和江口种植基地，其余为剑河野生，经贵阳医学院龙庆德教授鉴定为败酱科缬草属植物宽叶缬草Valeriana officinalis L.var. 1atifolia Miq。然后，选择全株植物上的幼嫩叶片作为提取基因组DNA的材料，-20℃下保存，样本编号和采集地点，见表1。

表1 样本来源Tab.1 Sources of samples

1.2 仪器 TGL-16C台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；XH-B漩涡混合器 （江苏康健医疗用品有限公司）；DYY-6C电泳仪（北京市六一仪器厂）；BIOMATE 3S核酸蛋白分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；S1000PCR扩增仪（美国Bio-Rad公司）；凝胶成像仪（香港基因有限公司）。

1.3 试剂和引物 DL2000 DNA Marker、DP-320新型植物基因组DNA高效提取试剂盒 （北京天根生化科技有限公司）；Taq酶、dNTP Mixture、Mg2+、Go1dViewⅠ核酸染色剂、10×buffer、50× TAE缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）；RAPD随机引物 （上海捷瑞生物工程有限公司）；西班牙琼脂糖 （香港基因有限公司）。所用试剂均为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 基因组DNA的提取及检测 按照DNA提取试剂盒的操作步骤进行提取，然后将提取后的基因组DNA在0.8%琼脂糖凝胶电泳上检测完整性，并用核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度［8］。

2.2 RAPD扩增反应 扩增反应体系在25μL体积中进行。其中，10×Buffer 2.5μL、Mg2+（25 mmo1/L）4μL、dNTPMixture（10 mmo1/L）1μL、Taq酶（5U）0.4μL、引物（50μmo1/L）2μL、模板浓度为60 ng，加ddH2O至25μL。PCR扩增程序为94℃下预变性3 min，然后94℃下变性1 min，34℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，进行30个循环，最后72℃下延伸5 min。取PCR扩增产物10μL，置于含1×TAE缓冲液的1.8%琼脂糖凝胶上，Go1dViewⅠ核酸染色剂染色，100 V恒压下电泳30 min，DNA Marker DL2000分子标记，凝胶成像系统观察并拍照。

2.3 引物筛选 本实验应用40条10个碱基长度的寡核苷酸随机引物，对上述提取后的样本基因组DNA进行RAPD预扩增，从中筛选出有多态性、条带清晰、重复性好的引物［9］。

2.4 数据统计 选取各样本扩增重复性好的条带（包括亮带和可识别的暗带）进行统计分析，RAPD为显性标记，同一引物的扩增产物在电泳中迁移率相同的条带可被认为是同源性的，有带（包括弱带）记为 “1”，无带记为 “0”，得到原始1/0数据矩阵，统计每个引物扩增出的总带数和其中的多态性带数，计算多态性带百分率 （percentage of po1ymorphicbands，PPB，多态位点数/位点总数）。然后，Popgene1.32软件计算Nei's多样性指数（h）和Shannon's多样性指数（I），NTSYS2.10e软件计算各样本间Jaccard遗传相似性系数（genetic simi1arity，GS），并获得遗传相似系数矩阵，再使用不加权成对群算术平均法 （Unweighted Pair-Group Method using arithmetic Average，UPGMA），以遗传相似系数为基础，构建系统树图［10-13］。

3 结果与分析

3.1 基因组DNA的提取结果 采用试剂盒所提取的基因组DNA溶液无色透明，无黏稠现象，而且电泳条带清晰，无拖尾现象，基因组DNA片段大小一致，说明提取较完整，见图1。样本基因组DNA浓度在20～50 ng/μL之间，OD260/280值在1.7～2.0之间，表明蛋白质等杂质的除去比较干净。依据各样本的OD260/280值，实验所提取的样本DNA纯度较高，质量好，适合后续RAPD的分析。

图1 DNA检测电泳图Fig.1 DNA electrophoretogram

3.2 宽叶缬草遗传多样性分析 本实验筛选出13条有效随机引物，获得了谱带清晰、多态性良好的图谱，引物序列及扩增结果见表2。通过对20份宽叶缬草样本基因组DNA扩增，得到亮带和可识别的弱带共102条，其中共有条带14条，多态性条带88条，多态性比率为86.27%，每条引物的多态性条带数在5～10条之间，平均扩增数为7.7条，多态条带率变幅为20%～100%，部分扩增图谱见图2。另外，从表3可以看出，宽叶缬草总的Nei's多样性指数（H）和Shannon's多样性指数（I）分别为0.303 0和0.453 7，其中在不同居群中前者的范围在0.184 4～0.257 9之间，而后者的范围在0.273 1～0.392 0之间，各独立居群的遗传多样性均低于总体宽叶缬草，并与Shannon指数的结果完全相符。

表2 引物序列及其扩增结果Tab.2 Result of primers sequences and their amplification

表3 不同种群宽叶缬草的遗传多样性指数Tab.3 Genetic d iversities in Valeriana officinalis L.var. latifolia M iq in different populations

3.3 遗传聚类分析 根据13条有效随机引物在20个样本中所获得的102条扩增条带，可计算出各样本间的遗传相似系数 （GS值），并得出遗传相似系数矩，见表4。结果表明，20个样本间的GS值分布较广，变化范围在0.411 8～0.882 4之间，说明其遗传背景较复杂，具有较高的遗传多态性。其中，2号和5号样本相似性系数最大，达0.88，说明它们的亲缘关系最近。基于样本间GS值，采用UPGMA法进行聚类分析，见图3。结果发现，这20个样本可分为两类，剑河地区的13个样本归为Ⅰ类，并且栽培与野生样本分为两个分支，而剩余7个样品归为Ⅱ类。另外，当GS值约为0.88时，可将20个宽叶缬草样本区分。

4 讨论

RAPD技术具有无需明确基因序列等特点，而利用一系列随机引物则能对整个基因组DNA进行多态性检测，可用于各种植物的遗传多样性分析和品种鉴别等方面［14］。目前，该技术由于其操作简便、灵敏性高、省时省力、不易受环境因素影响等优点，因此被广泛应用于中药材中，为中药现代化的快速发展提供了理论依据和现实意义［15］。

图2 引物5、21、37扩增的RAPD图谱Fig.2 Result of PCR amp lification using 5，21 and 37 RAPD p rimers

表4 基于RAPD分析的遗传相似系数Tab.4 Genetic sim ilarity coefficients on the basis of RAPD analysis

图3 20份宽叶缬草样本UPGMA聚类图Fig.3 UPGMA dendrogram of 20 Valeriana officinalis L.var.latifolia M iq sam ples

本实验利用RAPD技术，从DNA分子水平上分析了黔产宽叶缬草的的遗传多样性，而多态位点百分比（PPB）、Nei's基因多样性（H）与Shannon's基因多样性指数 （I）都是测量遗传多样性水平的常用指标［16］。实验发现，黔产宽叶缬草的多态性比率（PPB）为86.27%，而PPB在50%左右时即被认为是遗传多样性丰富［17］，故该植物在种群水平上具有较高的遗传多样性。另外，由遗传相似系数图表可知，各样本间的相似性系数在0.411 8～0.882 4之间，说明宽叶缬草种内具有丰富的多态性。而且，Nei's（H）和Shannon's多样性指数 （I）统计结果显示，栽培型宽叶缬草种群间的遗传多样性水平差异不大，但与野生种群间存在一定的遗传变异。研究表明［18］，RAPD标记划分的类型同地理分布有一定关系，地理位置较近的样本大多能聚到一起。剑河地区的宽叶缬草大多为粗放型栽培，几无后期田间管理，人为因素影响较小，与当地野生宽叶缬草的生长环境相似；江口地区所栽培的宽叶缬草具有一定的规范性与规模性，人为因素影响较大。在人工栽培中，人们往往对种质资源进行了有意识地选择，筛选出较好的生产用种 （苗），这在一定程度上对宽叶缬草的种质资源进行了选种与育种。由聚类图谱可知，各样本可聚为两类，第Ⅰ类包括剑河地区的两个群居，共13个样本，并在阈值约0.65处分为栽培与野生样本两个分支，而江口地区的7个样本在阈值约0.62处聚为第Ⅱ类，总体上呈现地域性分布。

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RAPD analysis of Valeriana officinalis L.var.latifolia M iq collected from Guizhou Province

QIAN Zhi-yao， ZHOU Mei， HUANG Xiu-ping， ZHOU Dao-tang， QIN Rong-gui*

（College of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

AIMTo exp1ore the genetic diversity of Xiecao（Valeriana officinalis L.var.latifolia Miq）co1-1ected from Guizhou Province atmo1ecu1ar 1eve1.METHODSThe extraction kitwas used to extract the genomic DNA of Xiecao samp1es，then they were amp1ified with 13 random primers screened from 40 primersby random amp1ified po1ymorphic DNA（RAPD）.The Nei's gene diversity and Shannon's information index were ca1cu1ated by Popgene 1.32，Jaccard genetic simi1arity coefficients were ca1cu1ated by NTSYS 2.10e，and c1uster ana1ysis was carried outby UPGMA method.RESULTSWith DNA amp1ification，tota11y 102 bands were amp1ified from 20 samp1es，88 of which were po1ymorphic with the po1ymorphism rate of 86.27%.The Nei's gene diversity and Shannon's information index were 0.303 0 and 0.453 7，respective1y.The Jaccard genetic simi1arity coefficients fe11between 0.411 8 and 0.882 4.The UPGMA ana1ysis c1assified 20 samp1es into 2 groups，13 samp1es from Jianhe County were c1ustered into one group，whi1e 7 samp1es from Jiangkou County were c1ustered into the other group.In additaion，the former was a1so subdivided into cu1tivated and wi1d samp1es.CONCLUSIONThere is an abundant genetic diversity in Xiecao co11ected from Guizhou Province at species 1eve1.And RAPD markers can provide the basis for the seed se1ection and breeding of this p1ant.

Xiecao（Valeriana officinalis L.var.latifolia Miq）；RAPD；genetic diversity；c1uster ana1ysis

R931.2

A

1001-1528（2015）08-1751-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.026

2014-09-16

贵州省中药攻关项目 （黔科合ZY［2011］3008）；贵州省高层次人才特助经费项目 （TZJF-2010-053）

钱志瑶 （1990—），女，硕士，研究方向为中药资源及质量评价。Te1：15285135995，E-mai1：95661575@qq.com

*通信作者：覃容贵 （1970—），女，博士，教授，研究方向为中药资源及质量评价。Te1：18984114150，E-mai1：1346812934@ qq.com