杨锦玲， 梅文莉， 蔡彩虹， 董文化， 陈亮亮， 戴好富*

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南省沉香工程技术研究中心，海南 海口 571101；2.海南大学园艺园林学院，海南海口570228）

黄奇楠生物活性和化学成分的研究

杨锦玲1，2， 梅文莉1， 蔡彩虹1， 董文化1， 陈亮亮1， 戴好富1*

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南省沉香工程技术研究中心，海南 海口 571101；2.海南大学园艺园林学院，海南海口570228）

目的研究黄奇楠的生物活性，并分析其化学成分。方法对黄奇楠乙醚提取物进行抗菌、抗肿瘤、乙酰胆碱酯酶抑制和降血糖活性测试，然后应用HP6890/5975CGC/MS联用仪分析其化学成分。结果乙醚提取物对金黄色葡萄球菌、慢性髓原白血病细胞K562、人胃癌细胞SGC-7901、乙酰胆碱酯酶和α-葡萄糖苷酶均表现出较好的抑制活性。同时，GC-MS检测到30个成分 （相对含有量为91.46%），并鉴定了其中26个化合物，包括16个倍半萜类成分（相对含有量为52.94%）和3个2-（2-苯乙基）色酮类成分 （相对含有量为16.09%）。其中，有7个倍半萜具有香味（相对含有量为36.29%）。结论黄奇楠乙醚提取物具有抗菌、抗肿瘤、乙酰胆碱酯酶抑制和降血糖活性，并含有多种化学成分，主要为倍半萜类型。

黄奇楠；乙醚提取物；抗菌；抗肿瘤；乙酰胆碱脂酶抑制；降血糖；GC-MS；化学成分

沉香为瑞香科沉香属植物中含有树脂的木材，其中白木香Aquilaria sinensis是我国唯一的沉香基源植物，主产于海南、广东等地［1-3］。沉香为我国传统名贵中药，可作为镇静和镇痛剂，具有降气温中，暖肾纳气功效，用于治疗喘息、胃痛、呕吐呃逆、脘腹胀痛、腰膝虚冷、大肠虚秘、胃痛、咳嗽、风湿和高热等症状［1，4］，其作为药物，最早记载于梁代陶弘景的 《名医别录》［5］。至今，该植物已是160多个中成药的主要组方原料，例如沉香化滞丸、沉香养胃丸、常松八味沉香片、著名良药“救心丸”等［4，6］。除作药用外，沉香因具有独特的芳香气味，也被大量用于熏香香料行业。研究表明，色酮和倍半萜类化合物是沉香的特征性成分，其中倍半萜成分包括沉香螺旋烷型、沉香呋喃型、愈创木烷型、杜松烷型、桉烷型、孤木烷型等多种骨架类型。

奇楠被认为是沉香中最上等和珍贵的品种，又名伽楠、伽罗、琪南、伽南沉等，英文名有Kanankoh、Kyara、Chi-Nan、Qi-Nan等［7］。据记载，奇楠外表油润光滑，油性重，以指甲刻之，如锥画沙，油随即溢出，用刀刮削后能捻捏成丸成饼，散发出耐久的幽香，其味微苦麻辣，嚼之粘牙，燃之出油，而普通沉香质坚，雕剔之如刀刮竹［8］。根据外表和断面的颜色，它可分为绿油伽楠香 （绿奇）、紫油伽楠香 （紫奇）、黑油伽楠香 （黑奇）、茶油伽楠香 （黄奇）等［8］。

传统鉴别奇楠与普通沉香的方法主要是基于其芳香气味和外观差别等感官评价。本课题组前期利用GC-MS来分析海南白奇、海南紫奇、海南绿奇和越南绿奇中的化学成分，结果发现奇楠乙醚提取物的得率 （34%～45%）明显高于普通沉香 （1.3%～9.7%），而且其中两个主要化合物2-（2-苯乙基）色酮和2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮的相对含有量之和 （66.47%～84.71%）也明显高于普通沉香 （0.16%～13.30%）。因此，可将以上两种成分作为奇楠和沉香的质量评价指标［7］。

沉香的药用价值极高，是我国及东南亚国家沿用历史悠久的珍贵传统药材，其粗提物的药理活性也受到了国内外广泛的关注。周永标［9］研究了沉香水煎液对肠平滑肌的药理活性，发现它对胃肠平滑肌的解痉有直接作用。Okugawa等［10］报道，沉香的苯提取物可降低环戊巴比妥睡眠小鼠的直肠温度，能使小鼠睡眠时间延长。Kim等［11］研究表明，沉香水提物通过抑制肥大细胞中组胺的释放，可以抑制速发型过敏反应的发生。梅文莉等［12］发现，沉香的挥发油成分对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA具有显著的抑制活性。Wetwitayak1ung等［13］应用水蒸气蒸馏法和超临界流体萃取法 （用和不用乙醇为辅助溶剂）提取沉香的化学成分，并分析其抗菌活性，结果发现这3种方法提取的沉香精油对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和白色念珠菌Candida albicans均具有抑制活性，但对大肠杆菌Escherichia coli无明显作用。Suwannasing等［14］报道，沉香的乙酸乙酯提取物可保护心脏因心肌缺血或再灌注引起的损伤，能部分抑制p38 MAPK磷酸化。然而，迄今有关奇楠粗提物的药理活性研究鲜见报道，因此本实验将对黄奇楠乙醚提取物的抗菌、抗肿瘤、乙酰胆碱酯酶抑制和降血糖活性进行测试，并应用GC-MS法分析其化学成分。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂 HP6890/5975C GC/MS联用仪，包括ZB-5MSI弹性石英毛细管色谱柱 （30 m×0.25 mm，0.25μm，流动相为5%Pheny1-95% DiMethy1po1ysi1oxane，美国安捷伦公司）；ELX-800酶标仪（美国宝特公司）；Shimadzu UV-2550紫外可见分光光度计 （美国 Beckman公司）；HHB11360-S普通培养箱 （上海跃进医疗器械有限公司）；SW-40洁净工作台 （上海博迅实业有限公司）；BP221S电子秤 （万分之一，北京赛多利斯天平有限公司）；HVE-50高压蒸汽灭菌锅 （日本Hirayama公司）。所用试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.2 活性测试材料

1.1.2.1 抗菌活性测试 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 51650（海南省药品检验所）；硫酸卡那霉素 （生工生物工程上海股份有限公司）。培养基采用牛肉膏蛋白胨琼脂 （NA），配方为牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaC15 g，定容至1 L，pH在7.4～7.6之间。

1.1.2.2 细胞毒活性测试 人胃癌细胞SGC-7901、人慢性髓原白血病细胞K562（中国科学院上海生命科学研究院细胞库）；紫杉醇 （江苏红豆杉药业有限公司）。肿瘤细胞株于完全RPMI-1640培养基中培养。

1.1.2.3 乙酰胆碱酯酶抑制活性测试 S-硫代乙酰胆碱、5，5＇-二硫-双-2-硝基苯甲酸（DTNB，E11-man试剂）、乙酰胆碱酯酶（美国Sigma Chemica1公司）；他克林（纯度为99%，美国Sigma-A1drich公司）。

1.1.2.4 体外α-葡萄糖苷酶抑制活性 阿卡波糖（拜糖平，批号BJ12559，德国拜耳公司）；α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20，批号MGI01，东京TLC公司）；对硝基苯-α-葡萄糖苷（pNPG，美国Sigma Chemica1公司）。磷酸钾、无水乙醇、二甲基亚砜、氯化钠和碳酸钠均为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.3 样品 黄奇楠样品于2014年4月购自广东省化州市，经中国热带农业科学院热带生物技术研究所戴好富研究员鉴定，其源植物为白木香Aquilaria sinensis。该植物结香部位靠近树皮，内侧面土黄色木质部上密布黑褐色油脂，外侧面亦为土黄色，油脂分布少，木性较重。常温下，其花香味浓郁，凉味较重，并且嚼之粘牙，入口先有辣味，后渐转凉苦味，嚼后口中留香持久，凉辛味重，可削成卷，标本 （编号201405HQN）保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所，见图1。

图1 黄奇楠沉香样品Fig.1 Huangqi'nan agarwood sample

1.2 方法

1.2.1 样品制备 黄奇楠切碎后精密称取50.000 g，乙醚超声提取3次，每次100 m L，超声15 min，静置5 min后过滤，得到乙醚提取液，合并挥干，即得黄奇楠乙醚提取物11.870 g，计算出其质量占样品干质量的23.74%。

1.2.2 抗菌活性测试 采用滤纸片琼脂扩散法［15］，将金黄色葡萄球菌制成一定浓度的菌悬液（105～107 cfu/m L）后取100μL，用棉签将其均匀涂于供试无菌牛肉膏蛋白胨琼脂培养基NA平板上，制成含菌平板。然后，将样品配成质量浓度为10 mg/m L的溶液，取50μL，滴加于灭菌滤纸片上 （Φ=6 mm），待溶剂挥干后将其贴于含菌平板上，重复3次。0.08 mg/mL硫酸卡那霉素10μL作为阳性对照，37℃恒温条件下培养，24 h后观察结果，测量并记录抑菌圈直径。

1.2.3 细胞毒活性测试 肿瘤细胞培养的条件为37℃、5%CO2、相对湿度 90%以上，在含有10%小牛血清的完全RPMI-1640培养基中充分培养。然后，以K562和SGC-7901细胞为指示瘤株，MTT法测定［16］，设DMSO溶剂阴性对照组、阳性对照组 （紫杉醇）和待测样品组，其中待测样品组中设6个质量浓度梯度 （0.1、0.3、0.9、2.7、8.1和24.3μg/mL）。取对数生长期细胞，于完全RPMI 1640培养基中制成单细胞悬浮液，血球计数板计数，在96孔平底细胞培养板中按50 000个/mL接种90μL。K562细胞株中加入样品10μL和SGC-7901细胞株 （不加样品），培养24 h后再加入样品10μL，培养条件为5%CO2、湿度90%以上、37℃，继续培养72 h，取出后置于显微镜下观察每孔细胞形态。然后，加入5 mg/mL的MTT溶液15μL，37℃下反应4 h后，弃除上清液，再往各孔加入DMSO 100μL，充分溶解后用ELX-800酶标仪测量各孔在490 nm处的OD值，按公式1计算抑制率，重复3次，再以样品质量浓度为横坐标，样品的抑制率为纵坐标作图，求出抑制率为50%时样品的质量浓度 （IC50）。

抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/（对照组OD值）×100% （公式1）

1.2.4 乙酰胆碱酯酶的抑制活性测试 采用改进的E11man法［17］，将样品溶解于DMSO中，在含有磷酸缓冲液（pH=8.0）、测试样品（50μg/mL）和乙酰胆碱酯酶 （0.02 U/mL）的最终反应体系200μL中，先在30℃下孵育20 min，然后于405 nm紫外波长下测量两次背景值。接着，加入2.48 mg/mL DTNB和1.81 mg/mL硫代乙酰胆碱的等体积混合液40μL开始反应，将反应体系置于405 nm紫外波长下检测1 h。以他克林作为阳性对照，反应终质量浓度为0.08μg/mL；DMSO为阴性对照，反应终浓度为0.1%，重复3次，再选择阴性对照组平均吸光值约为1的样品吸光值，计算其平均值 （化合物测定值-背景值），根据公式2计算样品的抑制率。

抑制率=（E-S）/E×100% （公式2）

注：E为阴性对照组的平均吸光值；S为样品的平均吸光值。

1.2.5 降血糖活性测试 采用优化后的贤景春［18-19］报道的方法测试。取0.1 mmo1/L的磷酸钾缓冲液（pH为6.8）0.5 mL，加入10 mg/Lα-葡萄糖苷酶100μL和样品溶液0.5mL，混匀后37℃下恒温加热15 min，再加入2.5 mmo1/L pNPG 0.5 m L，混匀后37℃下恒温加热15 min，最后加入0.2 mo1/L Na2CO3溶液1 mL终止反应，于405 nm波长下测定OD值，重复3次，取平均值。以阿卡波糖为阳性对照，分别检测不同质量浓度的黄奇楠乙醚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，按公式3计算其抑制率和IC50值。

酶活性抑制率=［A空白-（A样品-A背景）］/ A空白×100% （公式3）

注：A空白为不加待测样品，只加入待测样品的溶剂，进行反应后的吸光值；A样品为加入待测样品反应后的吸光值；A背景为只加待测样品反应后的吸光值。

1.2.6 GC-MS分析条件

1.2.6.1 色谱条件 ZB-5MSI弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；流动相为5% Pheny1-95%DiMethy1po1ysi1oxane；初始柱温50℃，然后以5℃/min的速率升至310℃，保持10 min；汽化室温度250℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压7.62 psi（1 psi=6.895 kPa）；载气体积流量1.0 mL/min；分流比40∶1；溶剂延迟时间3.0 min。

1.2.6.2 质谱条件 电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；发射电流34.6μA；倍增器电压1 612 V；质量扫描范围m/z20～550。

2 结果与分析

2.1 活性测试结果

2.1.1 抗菌活性测定 滤纸片琼脂扩散法测定黄奇楠乙醚粗取物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。结果表明，它对金黄色葡萄球菌有抑制作用，抑菌圈直径为（11.57±0.14）mm，而阳性对照青霉素的抑菌圈直径为（27.66±0.21）mm。

2.1.2 细胞毒活性测定 MTT法测定黄奇楠乙醚粗取物对慢性髓原白血病细胞K562和人胃癌细胞SGC-7901的细胞毒活性。结果表明，它对两者的生长均有不同程度的抑制作用，对K562的IC50值为（12.77±0.18）μg/m L，而阳性对照紫杉醇的IC50值为（6.22±0.20）μg/m L；对SGC-7901的IC50值为（14.67±0.23）μg/mL，而紫杉醇的IC50值为（3.24±0.15）μg/mL。

2.1.3 乙酰胆碱酯酶的抑制活性测定 E11man法测试黄奇楠乙醚粗取物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。结果表明，它对乙酰胆碱酯酶的抑制率为（24.85±0.22）%，而阳性对照他克林的抑制率为（42.61±0.15）%。

2.1.4 降血糖活性测定 优化后的贤景春法［18-19］测试黄奇楠乙醚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明，它对α-葡萄糖苷酶有很强的抑制作用，IC50值为（268.75±0.42）μg/m L，明显小于阳性对照阿卡波糖（788.36±0.57）μg/m L。

2.2 GC-MS分析结果 黄奇楠沉香样品乙醚提取物的总离子流图见图2，对图中各峰通过质谱数据系统检索及核对Nist2005和Wi1ey275标准质谱图，并借鉴前期的鉴定方法［2，7，20-21］，结合质谱图与文献数据进行鉴定。结果，在提取物中检测到30个色谱峰 （表1），并用峰面积归一化法测定出它们在样品中的相对含有量为91.46%。最终，确定了5种类型的倍半萜类化合物16个 （52.94%），其中孤木烷型6个 （23.59%）、愈创木烷型5个（16.30%）、沉香螺旋醇型3个 （10.12%）、沉香呋喃型1个 （2.63%）、降倍半萜1个 （0.30%），2-（2-苯乙基）色酮类化合物3个 （16.09%），烷烃类化合物4个 （0.42%），甾体类化合物3个（0.53%），另有4个色谱峰尚未鉴定。同时发现，该样品中的主要成分为倍半萜类化合物，而色酮类化合物的种类和含有量均较少，见表1。除此之外，本实验共检出7个有香味的倍半萜［7，22］，相对含有量为36.29%，分别为（-）-愈创木-1（10），11-二烯-15-醛 （7.22%）、（-）-愈创木-1（10），11-二烯-15，2-内酯 （5.98%）、沉香螺旋醇 （1.09%）、白木香醛 （3.18%）、二氢卡拉酮 （7.35%）、新紫蜂斗菜烯（10.03%）、7α-H-9（10）-烯-11，12-环氧-8-氧艾里莫芬（1.44%）。

3 结论与讨论

本实验采用乙醚提取法提取黄奇楠，得率为23.74%，明显高于普通沉香的乙醚提取得率（1.3%～9.7%）［7］。基于前期研究，对黄奇楠乙醚提取物进行抗菌、抗肿瘤、乙酰胆碱酯酶抑制和降血糖活性测试。梅文莉、Wetwitayak1ung等［12-13］均报道沉香提取物具有抗金黄色葡萄球菌的活性，而本实验发现黄奇楠乙醚粗提物对该细菌也具有抑制作用。文献报道，沉香中的一些倍半萜类成分能抑制和安定中枢神经系统［10，34-36］，而色酮类成分则具有神经细胞保护作用［37-38］，本实验也表明，它对乙酰胆碱酯酶也有一定的抑制作用。乙酰胆碱酯酶是水解乙酰胆碱的特异性胆碱酯酶，而其含有量的降低会引发神经退行性疾病，而黄奇楠乙醚提取物可在一定程度上抑制乙酰胆碱酯酶的活性，显示它对神经系统具有保护作用。同时，本实验还发现该提取物对慢性髓原白血病细胞K562、人胃癌细胞SGC-7901和α-葡萄糖苷酶均表现出较好的抑制活性，这也是首次发现黄奇楠具有抗肿瘤和降血糖的活性。

图2 黄奇楠沉香的GC-MS总离子流图Fig.2 The GC-MS total iron chart of Huangqi'nan agarwood

表1 黄奇楠沉香乙醚提取物中的化学成分Tab.1 Chem ical constituents of Huangqi'nan agarwood etheral extract

续表1

另外，通过GC-MS检测出样品中有30个成分，相对含有量为 91.46%。首先，通过核对Nist2005和Wi1ey275标准质谱图来进行鉴定，但是只确定了3个倍半萜类成分，而绝大多数倍半萜和所有色酮类化合物都无法鉴定，主要是因为沉香中很多特征性成分的质谱数据尚未入库，故通过谱库对比很难鉴定这些成分。近年来，人们通过人工检索和化合物质谱数据比对，推断出沉香提取物中色酮类化合物的结构［21，39-40］，其中梅文莉等［2，34］通过分析色酮类化合物的质谱数据，并结合文献，总结出沉香中大量存在的特征性f1idersia类色酮化合物的EI-MS质谱特征和鉴定方法，本实验也主要参考了该方法。而倍半萜类成分则主要通过对比文献质谱数据或标准化合物的谱图进行确认，但仍有4个化合物未能鉴定。本实验检测到的3个色酮类成分相对含有量总和为16.09%，其中2-（2-苯乙基）色酮与2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮相对含有量总和为14.40%。梅文莉等［2］报道，国产绿奇楠中这2个化合物总和为58.48%，而杨德兰［7］发现，海南白奇、海南紫奇、海南绿奇和越南绿奇中两者总和分别为66.47%、82.09%、84.71%和71.98%，本实验中上述两个色酮类成分相对含有量较低的主要原因可能是黄奇楠样品的结香部位靠近树皮，故倍半萜类成分含有量较高，从而降低了色酮的相对含有量，并在常温下香味更浓郁。梅文莉等［2，7］研究表明，奇楠沉香的结香部位靠近树心，其中倍半萜类成分含有量较低，主要为色酮类化合物，由于结香位置不同，两者在主成分类别上有一定的差异。

一些倍半萜具有抗菌活性，而本实验样品中16个倍半萜的相对含有量总和为52.94%，可能是其具有抗菌活性的主要原因，但具体活性成分有待进一步研究。杨德兰等［22，41-42］发现，2-［2-（2-羟基-4-甲氧基苯）乙基］色酮、7α-H-9（10）-烯-11，12-环氧-8-氧艾里莫芬和新紫蜂斗菜烯均具有乙酰胆碱脂酶抑制活性，三者在黄奇楠乙醚提取物中相对含有量总和为13.16%，可能是该样品具有乙酰胆碱脂酶抑制活性的重要活性成分。Okugawa等［43］报道，沉香雅槛蓝醇和螺旋醇可作用于小鼠神经中枢，使环己巴比妥引起的小鼠睡眠时间延长，具有良好的镇静和镇痛作用。安娜贝拉等［44］发现，两者均能显著抑制醋酸引起的小鼠扭体反应，其中沉香螺旋醇还可减少由脱氧麻黄碱和阿扑吗啡诱导的自发性运动，增加大脑内高香草酸的含有量，可能是沉香镇静安神作用的重要活性成分。

在鉴定出的16个倍半萜中，7个有香味，相对含有量总和为36.29%，是常温下样品散发浓郁香味的主要来源。其中，沉香螺旋醇、新紫蜂斗菜烯和7α-H-9（10）-烯-11，12-环氧-8-氧艾里莫芬是沉香重要的香味和活性成分。本实验通过对黄奇楠初步的活性研究，并采用GC-MS分析其中的化学成分，可为更好地开发黄奇楠的药用价值和进一步追踪其活性成分提供了科学依据和参考。

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Bioactivities and chem ical constituents of Huangqi'nan

YANG Jin-1ing1，2， MEI Wen-1i1， CAI Cai-hong1， DONG Wen-hua1， CHEN Liang-1iang1，
DAIHao-fu1*

（1.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences；Hainan Engineering Research Center of Agarwood，Haikou 571101，China；2.Horticultural and Garden College，Hainan University，Haikou 570228，China）

AIMTo study the bioactivities and chemica1 constituents of Huangqi'nan etherea1 extract.METHODSThe antibacteria1，antitumor，acety1cho1inesterase（AChE）inhibitory and hypog1ycemic activities of Huangqi'nan etherea1extractwere tested.Then the chemica1constituents of this p1antwere ana1yzed by HP6890/ 5975C GC-MS.RESULTSThe Huangqi'nan etherea1extract showed antibacteria1activity toward Staphylococcus aureus，antitumor activity toward chronic mye1ogenous 1eukemia ce11s K562 and human gastric carcinoma ce11s SGC-7901，AChE inhibitory activity andα-g1ucosidase inhibitory activity.Meanwhi1e，thirty compounds（91.46%），inc1uding 16 sesquiterpenes（52.94%）and three 2-（2-pheny1ethy1）chromone derivatives（16.09%）were identified.Among them，seven sesquiterpeneswere reported to be fragrant（36.29%）.CONCLUSIONThe Huangqi'nan etherea1extract has antibacteria1，antitumor，AChE inhibitory and hypog1ycemic activities，and contains various chemica1constituents，main1y ofwhich are sesquiterpenes.

Huangqi'nan；etherea1 extract；antibacteria1；antitumor；AChE inhibitory；hypog1ycemic；GCMS；chemica1constituents

R284.1

A

1001-1528（2015）08-1740-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.024

2014-09-22

公益性行业 （农业）科研专项 （201303117）；国家科技支撑计划课题项目 （2013BAI11B04）；海南省重大科技项目（ZDZX2013013）

杨锦玲（1990—），女，硕士，从事天然产物化学研究。E-mai1：jin1yang@126.com

*通信作者：戴好富（1974—），男，博士，研究员，从事天然产物化学研究。Te1：（0898）66961869，E-mai1：daihaofu@itbb.org.cn