相 琳， 曾 佳， 黄 婷*， 魏 莉

（1.大连大学，辽宁大连，116622；2.上海市计划生育科学研究所，国家人口和计划生育委员会计划生育药具重点实验室，上海生殖健康药具工程技术研究中心，上海200032；3.上海中医药大学，上海201203）

长春胺大鼠在体肠吸收特性

相 琳1， 曾 佳2， 黄 婷2*， 魏 莉3

（1.大连大学，辽宁大连，116622；2.上海市计划生育科学研究所，国家人口和计划生育委员会计划生育药具重点实验室，上海生殖健康药具工程技术研究中心，上海200032；3.上海中医药大学，上海201203）

目的研究长春胺在大鼠肠道的吸收特性。方法以酚红为标示物，酒石酸调节大鼠在体肠灌流液pH至4.5，采用HPLC-UV测定长春胺在大鼠各肠段的质量浓度变化。结果长春胺在大鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠中2.5 h内累积吸收百分率 （P a）分别为 （54.66±2.37）%、（54.21±2.48）%、（53.04±4.83）%、（53.78±4.86）%，吸收速率常数 （Ka）依次为 （0.248±0.020）/h、（0.183±0.058）/h、（0.231±0.046）/h、（0.200±0.069）/h。P a与Ka在各肠段均无显著性差异，说明无特殊吸收部位。结论加入酒石酸调节长春胺pH可促进其肠黏膜通透性，从而提高其口服生物利用度。

长春胺；pH依赖性；酒石酸；在体肠吸收；HPLC-UV

长春胺（vincamine）是从夹竹桃科植物小蔓长春花（Vinca minor L.）中提取的吲哚类生物碱［1］，具有良好的改善大脑血液循环功能，扩张脑血管和毛细血管，而不影响心脏血流量和全身血循环，可用于由脑供血不足而引起的多种疾病，以及伴发的各种精神异常和衰老期行为障碍等［2］。长春胺的半衰期仅为2 h［3］，如设计成普通制剂则每天需要频繁服药，因此临床上大多以其口服缓控释制剂为主，如商品名为奥勃兰的长春胺缓释胶囊等。另一方面，长春胺为典型的 pH依赖性药物［4］，即在酸性条件下可溶，中性及碱性环境难溶，溶解度随pH升高呈逐步下降趋势，该特点将导致长春胺口服制剂吸收差，生物利用度低。目前国内尚无长春胺肠道吸收研究的相关报道，本实验采用在体肠循环灌流模型法［5-10］，以酒石酸调节灌流液pH使长春胺溶解于其中，考察其在大鼠不同肠段的吸收特性，为研究开发长春胺口服制剂提供生物药剂学基础。

1 材料

1.1 仪器 HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器有限公司）；HHS-2指针式电热恒温水浴锅 （上海锦凯科学仪器有限公司）；Agi1ent8453紫外分光光度计（美国安捷伦公司）；Agi1ent 1200 series高效液相色谱仪 （美国安捷伦公司）。

1.2 药物与试剂 长春胺原料药（批号CV/ VC070515，纯度100.3%，西班牙考维克斯公司）；苯酚红 （AR F20070906，国药集团化学试剂有限公司）；乌拉坦 （CP T20061101，国药集团化学试剂有限公司）；Krebs-Ringer's试液（自制）；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；酒石酸 （AT 50/80，法国罗盖特公司）；其他试剂均为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 动物 雄性Wister大鼠，20只，体质量（200±20）g，上海中医药大学实验动物中心提供，许可证号SYXK（沪）2008-0016。

2 方法与结果

2.1 肠循环液中长春胺的HPLC测定方法

2.1.1 Krebs-Ringer缓冲液与空白肠循环液的制备

称取NaC17.8 g，KC10.35 g，CaC120.37 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgC120.02 g和葡萄糖1.4 g，加水溶解并稀释至1 L，即得Krebs-Ringer缓冲液。Krebs-Ringer缓冲液按“2.3.2”项下方法，经大鼠在体肠灌流后即得空白肠循环液。

2.1.2 色谱条件 Kromasi1C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流动相为0.02 mo1/L磷酸二氢钾溶液-乙腈 （70∶30），用磷酸调节pH至2.3；柱温25℃；体积流量1.0 mL/min；二极管阵列检测器，检测波长268 nm；进样量为10μL。在上述色谱条件下，空白肠循环液对长春胺的测定无干扰，色谱图见图1。

图1 长春胺肠灌流液HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of vincam ine in intestinal perfusion

2.1.3 标准曲线的制备 取长春胺原料药约100 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加入经酒石酸调节pH至4.5的空白肠循环液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为1.00 mg/mL的长春胺贮备液。精密量取该溶液以pH 4.5的空白肠循环液分别稀释配成质量浓度为10、20、40、60、80、100μg/mL的系列标准溶液，按 “2.1.2”项下方法测定，以峰面积 （A）为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为A= 13.657C-7.432（r=0.999 9），表明长春胺在10～100μg/m L质量浓度范围内线性关系良好。

2.1.4 回收率试验 精密量取长春胺贮备液分别配成10、40、80μg/mL 3个质量浓度的样品溶液，按 “2.1.2”项下方法测定，计算样品回收率分别为 （103.68±0.99）%、（99.22±0.77）%、（99.89±0.46）%，符合测定要求。

2.1.5 精密度试验 取10、40、80μg/mL 3个质量浓度样品溶液，按 “2.1.2”项下方法测定，分别在一天内测定5次，计算日内精密度，及每天测定1次共测定3 d，计算日间精密度。结果低、中、高3个质量浓度样品日内精密度的RSD分别为0.28%、0.56%、0.11%；日间精密度的RSD分别为1.29%、0.95%、1.16%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 配制质量浓度为40μg/mL的样品溶液共5份，按 “2.1.2”项下方法测定，结果RSD为1.37%，表明样品重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取10、40、80μg/mL 3个质量浓度的样品溶液，于37℃恒温水浴中放置2.5 h，分别于0、2.5 h取样，按 “2.1.2”项下方法测定，2.5 h后样品含量分别为 （99.32± 0.57）%、（99.25±1.85）%、（99.95±0.11）%，表明长春胺在pH 4.5的空白肠循环液中2.5 h内稳定性良好。

2.2 肠循环液中酚红的UV测定方法 用Krebs-Ringer缓冲液配制质量浓度分别为10、15、20、30、40、50μg/mL的系列酚红溶液，各精密吸取酚红溶液0.5 m L，加入0.2 mo1/L的氢氧化钠溶液5 m L，于559 nm处测定吸光度 （A），以A为纵坐标，质量浓度 （C）为横坐标，得回归方程A= 16.482C+0.011 8（r=0.999 9），线性范围为10～50μg/mL。取质量浓度分别为10、20、50 μg/mL的酚红溶液置于37℃恒温水浴中放置2.5 h后，测定吸光度，结果酚红浓度分别为0 h的（100.76±1.18）%、（101.88±0.61）%、（100.59± 1.02）%，表明酚红溶液在2.5 h内稳定。

2.3 大鼠在体肠吸收特性研究

2.3.1 供试液的制备 取酚红约100 mg，精密称定，置于100mL量瓶中，以Krebs-Ringer缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为1.00 mg/mL的酚红标准溶液。分别精密吸取该标准溶液2.0 mL和质量浓度为1.00 mg/mL长春胺贮备液4.0 mL至100 mL量瓶，用pH4.5的Krebs-Ringer缓冲液稀释至刻度，摇匀，制得长春胺质量浓度为40μg/mL且酚红质量浓度为20μg/mL的供试液。

2.3.2 不同肠段的药物吸收 取雄性Wister大鼠20只，按不同肠段分为4组，每组5只。试验前禁食18 h，称定质量后，用20%乌拉坦溶液以10 mL/kg大鼠的剂量腹腔注射麻醉，背位固定于手术板上，以红外灯照射保持37℃体温，沿腹中线切开腹部约3 cm。选择所需要考察的肠段：十二指肠自幽门1 cm处开始，空肠段离幽门15 cm开始，回肠段为距离盲肠20 cm处开始，结肠段为紧邻盲肠端至直肠，各段均取10 cm左右。在两端剪切后插管，结扎，先用37℃生理盐水将肠管充分洗涤后，再以空气排出生理盐水，用供试液以 2.0 m L/min的体积流量回流，分别于回流0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5 h取样5 mL，同时补加质量浓度为20μg/mL的酚红供试液5 m L。样品经0.45μm超滤膜滤过，取续滤液按 “2.1.2”项下色谱条件测定长春胺，同时取续滤液0.5 mL按“2.2”项下方法测定酚红。根据酚红质量浓度的变化矫正由于循环液体积的改变造成的药物质量浓度差。

长春胺在大鼠各肠段的吸收百分率 （P a）与吸收速率常数 （Ka）见表1，计算公式如下：P a= 1-（Cout/Cin）×（Vout/Vin）；Ka=（P a×Qin）/ V。其中，Cin和Cout分别为肠灌入液、肠流出液中药物的质量浓度 （μg/mL）；Vin和Vout分别为灌入和流出收集的灌流液体积 （m L）；Qin为肠道入口灌流液的体积流量（m L/min），V为灌流肠段体积（mL，V=πR2L）；L灌流肠段长度 （cm）。长春胺不溶于普通的Krebs-Ringer缓冲液，加入酒石酸调节pH至4.5后，长春胺可溶解。溶解状态的长春胺在大鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠的吸收百分率均在50%以上 （见表1）；采用SPSS 9.0软件对不同小肠吸收部位进行方差分析可知 （见表2和表3），P a与Ka均无显著性差异，说明溶解状态下，长春胺在肠道内吸收较好，且无特殊吸收部位，提示在长春胺口服制剂设计过程中，应采用适当的制剂手段如加入pH调节剂来促进药物溶解，以提高其口服生物利用度。

表1 长春胺在不同肠段中的吸收百分率和吸收速率常数Tab.1 Percent absorption and absorption rate constant of vincam ine in different intestinal segments

表2 长春胺在不同肠段的吸收百分率方差分析Tab.2 Percent absorption variance analysis of vincam ine in differen t intestinal segmen ts

表3 长春胺在不同肠段的吸收速率常数方差分析Tab.3 Absorption rate constant variance analysis of vincam ine in different intestinal segments

3 讨论

药物在胃肠道吸收特性的研究是制剂处方前研究的重要部分，根据药物的吸收特征设计合理剂型，可以延长药物在吸收部位的滞留时间，从而提高其口服生物利用度。小肠是药物消化吸收的主要部位，研究药物在肠道部位的吸收特征对于指导制剂的处方设计，尤其是缓控释制剂具有十分重要的意义。目前，研究药物肠道吸收的试验方法可分为体外试验法、在体试验法和体内试验法。其中，在体肠灌流法保证了试验时各种体液的供应，可保持肠道环境较完整的生理特征，以提高试验的生物活性，在体吸收特点与人体吸收的相关性也已有试验证实，因此本研究采用大鼠在体肠灌流法对长春胺在肠道的吸收特性进行了初步研究。

口服固体制剂在体内需经崩解、分散、溶出的过程，才能被生物膜吸收，其吸收速度主要受药物的溶出与跨膜转运过程的限制。当药物溶解或溶出速率足够快时，跨膜转运是药物吸收的限速过程；但当药物的溶解或溶出速率较慢时，溶解或溶出则成为药物吸收的限速过程。药物进入人体后需经过食道、胃以及整个肠段，在此期间药物的外环境pH变化较大 （各肠段的 pH分别为：十二指肠4.0～5.0、空肠5.0～6.0、回肠6.0～8.0、结肠7.0～8.0），如果药物溶解受环境pH影响，则其溶出会不稳定，从而导致药物无法透过肠道生物膜而被人体吸收。前期平衡溶解度试验表明，长春胺在0.1mo1/LHC1中溶解度为29.64 mg/mL，在pH 1.5 PBS中溶解度为10.31 mg/mL，在蒸馏水中溶解度为0.017 3 mg/m L，在pH6.8 PBS和pH 7.8 PBS中溶解度分别为0.042 mg/mL和0.009 6 mg/mL，以上结果提示长春胺为pH依赖性药物，随pH升高其溶解度呈下降趋势，这意味着环境因素对药物的释放、溶解存在很大制约。肠吸收预试验结果显示，不调节溶液pH根本无法检测到肠循环液中的长春胺，因此推断这是由于长春胺在碱性环境下不溶的缘故（Krebs-Ringer缓冲液的pH约为7.4，长春胺无法溶解于该pH环境），这为其大鼠在体肠吸收特性的研究带来一定困难。本实验研究结果表明，长春胺具有肠黏膜通透性，只要突破溶解这一限速环节，其在肠道内则具有较好的吸收能力 （溶解状态下的长春胺在整个肠段的吸收均在50%以上），提示在其制剂设计过程中，应考虑采取适当的措施如加入酒石酸调节处方微环境pH［11-14］等方法来增加药物溶解度，从而促进其口服制剂的体内吸收。

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Characteristics of intestinal vincam ine absorption in rats in vivo

XIANG Lin1， ZENG Jia2， HUANG Ting2*， WEILi3

（1.Dalian University，Dalian 116622，China；2.Shanghai Instituteof Planned Parenthood Research，Key Laboratory of Contraceptives and Devices Research，Shanghai Engineer and Technology Research Center of Reproductive Health Drug and Devices，Shanghai200032，China；3.ShanghaiUniversity of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

ABSTRACT：AIMTo investigate the intestina1absorption of vincamine in rats for the design of vincamine ora1 formu1ations.METHODSWith pheno1 red as the indicator，and tartaric acid as the pH-va1ue（pH 4.5）adjustor for the perfusion so1ution，in vivo intestina1 perfusion mode1was thus formed.And HPLC-UV was app1ied to measuring the vincamine concentrations in different intestina1segments.RESULTSPercent absorption（P a）of vincamine within 2.5 h in duodenum，jejunum，i1eum and co1on were（54.66±2.37）%，（54.21±2.48）%，（53.04±4.83）%，（53.78±4.86）%，with the absorption rate constants（Ka）being（0.248±0.020）/h，（0.183±0.058）/h，（0.231±0.046）/h，（0.200±0.069）/h，respective1y.No significant difference either in P a or Kawas indicative of specia1absorption sites.CONCLUSIONT artaric acid use can spike the intestina1vincamine permeabi1ity，and improve the ora1bioavai1abi1ity of the formu1ations.

vincamine；pH-dependent；tartaric acid；in vivo intestina1absorption；HPLC-UV

R966

A

1001-1528（2015）08-1695-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.013

2014-10-18

相 琳（1983—），女，硕士，讲师，从事药物新剂型与新技术研究。Te1：（0411）82829759，E-mai1：1ynnxiang@126.com

黄 婷 （1983—），女，硕士，助理研究员，从事药物新技术、新剂型研究。Te1：（021）64034614，E-mai1：ting-1emon@ 163.com