温玉洁，赵文龙，葛红霞

（张掖市森林病虫害防治检疫站，甘肃 张掖734000）

马兜铃（Aristolochia debilis Sieb et Zucc）属于马兜铃科（Aristolochiaceae）马兜铃属（Aristolochia）植物，全世界约有450余种，广泛分布在热带和温带地区，我国有56种，其中《中国植物志》记载39种，分别属于管花亚属和马兜铃亚属［1］。主要分布于我国黄河以南及长江流域，是一种用途广泛的中药材。根入药为青木香，有行气止痛，解毒消肿之效；茎入药为天仙藤，能疏风活血；果实入药为马兜铃，能清肺降气，止咳平喘［2］。据调查在陇西就有试种，是一种值得广泛种植并能够带来良好经济效益的中药材之一［3］。

随着马兜铃等中草药在我省的普遍种植，病害开始频繁发生，近年来，据调查，灰霉病发生较重，病毒病也普遍发生。查阅资料，关于中草药的病毒病在国内就有研究报道，如朱本明、陈作义等［4］检测出地黄黄斑病病株中的地黄黄斑病毒；余方平、杨力［5］从河南等地的地黄上分离到4种病毒，其中2种分别鉴定为烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）；申屠苏苏、王海利等［6］在半夏中检测到的病毒主要为黄瓜花叶病毒的天南星科株系和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）的天南星科株系，而关于马兜铃中的病毒病未见报道。因此，笔者对甘肃省马兜铃产区普遍发生的病毒进行检测，以期为马兜铃病毒病的防治提供依据。

关于病毒病的检测技术，目前有很多有效而且快速的方法，常用的有指示植物法、电子显微镜诊断法、PCR检测、血清学检测法等诊断方法［7］。其中PCR检测法是一种选择性体外酶促合成DNA片段的技术，它包括三个基本步骤：变性，退火，延伸。主要有反转录PCR，多重PCR，实时荧光PCR等［8］；血清学检测方法具有很高的特异性，灵敏度也高，常用的方法有酶联免疫吸附法.间接ELISA、双抗体夹心法等多种测试方法。其中最主要的、应用最多的是双抗体夹心法和间接法，琼脂双扩散法，斑点免疫法［9］。如侯红琴、谭志琼等［10］提出利用病毒基因组核苷酸序列相似性来进行病毒种或株系的划分已成为病毒分类的一个有效手段；王敏、李明福等［11］对河南省焦作地区和山东省菏泽产地的地黄病毒病疑似样本，利用血清学、PCR并结合序列测定等方法进行鉴定与检测，张桦、黄炜等［12］还应用ELISA和PCR方法对小麦腥黑穗病菌进行检测研究。因此，根据这些资料，笔者拟采用双抗夹心法和RTPCR技术同时检测马兜铃病毒病的毒源种类，以期精确检测出甘肃省马兜铃病毒病的主要毒源种类，为制定综合防治策略提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物 2012年7月在甘肃定西岷县、陇西地区采集马兜铃病株，症状类型依据采集时间的不同进行编号，并在实验室－80℃冰箱冻存。

1.1.2 药品 血清学测定采用TIANGEN Agdia公司生产的酶联诊断试剂盒。包括：烟草花叶病毒、番茄花叶病毒（ToMV，Tomato mosaic virus）、马铃薯Y病毒（PVY，Potato virus Y）、马铃薯X病毒（PVX，Potato virus X）、黄瓜花叶病毒。

植物总RNA提取试剂盒购自天根公司。

1.1.3 仪器 研钵、恒温培养箱、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、移液枪、37℃恒温箱、酶标仪（450nm）、96孔酶联板、微量移液器、PCR扩增仪。

1.2 方法

1.2.1 症状分类 对采集到的样品根据症状类型，进行分类，照相。

1.2.2 马兜铃病毒病毒源的血清学检测 DASELISA双抗体夹心酶联免疫吸附法检测病毒具体步骤：

（1）样本制备：切割样本，分别置于灭菌研钵中，加一定量的PBS（pH7.4），迅速将样本匀浆充分。4℃下6 000r·min－1离心20min，仔细收集上清液，将样品对应微孔按序编号，根据检测需要设计96孔酶联板，每个重复3次，空白对照孔不加样品及酶标试剂（表1）。

（2）包被抗体：将 TMV、ToMV、CMV、PVX、PVY的抗体按照要求的浓度（200∶1）和需要的体积，用包被缓冲液稀释包被的抗体并且在每孔中加入100μL抗体IgG溶液，孵育4h或者4℃冰箱过夜。

表1 酶联板点样孔排列

（3）洗板：空干后用1×PBST洗涤液洗涤酶联板3次。

（4）加液：每孔加入100μL PNP溶液，室温孵育0.5h。

1.2.3 马兜铃病毒病的RT－PCR检测 当DAS－ELISA试验检测结果为阳性或疑似样品时，进行RT－PCR检测。

（1）植物基因组总RNA的提取

采用Tiangen RNA prep Pure Plant Kit植物总RNA提取试剂盒提取，试验步骤按试剂盒说明书进行，具体步骤如下：

1）匀浆处理：50～100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μL RL，涡旋剧烈震荡均匀。

2）移液离心：将所有溶液移至过滤柱CS上，12 000r·min－1离心2～5min，小心吸取收集管中的上清至Rnase－free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

3）转液：缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的沉底和溶液一起转入吸附柱CR3中，12 000r·min－1离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

4）收集：向吸附柱CR3中加入350μL蛋白液RW1，12 000r·min－1离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

5）DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放到新的Rnase－Free离心管中，加入70μL rRDD溶液，轻柔混匀。

6）加液：向吸附柱CR3中央加入80μL的Dnase I工作液，室温放置15min。

7）重复步骤4）。

8）漂洗收集：向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12 000r·min－1离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

9）重复步骤8）。

10）晾干漂洗液：12 000r·min－1离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11）静置：将吸附柱CR3放入一个新的Rnase－Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30～100μL Rnase－Free dH2O，室温放置2min，12 000r·min－1离心2min，得到RNA溶液。

（2）引物设计

根据已发表的CMV和ToMV的外壳蛋白基因序列［6－8］，设计引物序列：

CMV上游引物：Pcmv1d：5’－GCCGTAAGCTGGATGGACAA－3’，下游引物：Pcmv2u：5’－TATGATAAGAAGCTTGTTTCGCG－3’。

ToMV上游引物：PTob－Uni1：5’－ATTTAAGTGGASGGAAAAVCACT－3’，下游引物：PTomvf：5’－CGGAAGGCCTAAACCAAAAAG－3’。

（3）RT－PCR反应体系

根据预试结果，建立优化反应体系：2×1step Buffer 12.5μL，PrimeScript 1step Enzyme Mix 1 μL，引物1、引物2 （10μM）各1μL，Rnase Free dH2O 8μL，RNA模板1.5μL。

（4）RT－PCR扩增反应条件

根据预试结果，建立优化反应参数：95℃预变性30min；94℃变性3min，94℃退火30s，48℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。

（5）PCR产物电泳

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和EB染色观察。制备2%琼脂糖凝胶，待冷却至50～60℃时，加入EB混匀后倒入已经封好的凝胶平台上。10μL样品中加入2μL 5×loading Buffer，混匀加样，电泳槽中进行电泳。

2 结果与分析

2.1 症状

从田间采集到的马兜铃病毒病主要有2种症状类型：黄斑型，叶片的叶肉组织出现大小不等的黄色斑块，有些组织褪绿形成隐约可见的黄斑，而有些组织形成明显可见的近圆形鲜黄色斑块，整体叶片变小并呈现缺刻变形（图1）；网纹型，叶片大小叶脉组织均变黄，叶肉组织为正常绿色，整个叶片形成黄色网纹型症状（图2）。

图1 马兜铃病毒病黄斑型症状

图2 马兜铃病毒病网纹型症状

2.2 血清学检测结果

2.2.1 DAS－ELISA检测结果所得数据（表2）

表2 酶标仪数据

若样品对照OD405值/阴性对照OD405值明显＞2，为阳性；若样品对照OD405值/阴性对照OD405值在阈值附近，判为可疑样品，需重做一次，再用RT－PCR方法加以验证。试验表明：在待测黄斑型样品中，CMV I/H 值为4.14，初步确定为阳性样品，而ToMV I/H值为1.90，在其阈值范围内，则为可疑样品，需用RT－PCR进一步检测，而其余三种病毒试剂盒检测的马兜铃病叶汁液OD405均在1.5以下，则为阴性，即在马兜铃病叶中并未检测到TMV、PVX、PVY这三种病毒。在网纹型样品中对照OD405值明显小于阴性对照OD405值，所以排除了网纹型样品中含有这几种病毒的可能。

2.3 RT－PCR检测结果

对DAS－ELISA检测后的一个阳性样品和一个疑似样品进一步通过RT－PCR检测，结果表明：已扩增到了CMV约485bp［13］的特异性序列和ToMV约686bp［14］的特异性序列，表明在马兜铃黄斑型病叶中含有CMV和ToMV（图3）。

图3

3 小结与讨论

通过DAS－ELISA检测和RT－PCR分子检测，结合采集到的马兜铃样本上的症状，明确了CMV、ToMV是侵染我省马兜铃的主要病毒毒源，并且在黄斑型的症状中均检测到这两种病毒，说明存在复合侵染的现象。ELISA法的灵敏度不够高，而且容易出现非特异性反应。与ELISA相比，RT－PCR克服了抗原制备抗血清的种种弊端，并且含量极低的样品也可检测出，其灵敏性、特异性远超过ELISA方法，但是RT－PCR反应条件严格，反应体系中的诸多因素都会影响试验结果的稳定性。本试验根据TaKaRa公司的引物，通过ELISA和RT－PCR方法成功对我省定西、陇西马兜铃上的CMV、ToMV进行了检测，表明这两种方法是检测马兜铃病毒病的有效方法。在本实验中，田间自然感病马兜铃是否还受其他病毒感染，以及是否存在单独侵染，还有待于进一步研究。

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