韩建文 白云花 孙志强 阿拉腾楚鲁 刘佳 吕新翔 乌日娜

银屑病是一种以红斑、鳞屑为主要表现的慢性炎症性皮肤病，遗传因素在银屑病发病中起到重要作用［1-2］，在中国患病率为 0.47%［3］。近年来遗传关联研究发现一大批银屑病相关的易感基因［4-6］。特别是一些易感基因与其他自身免疫病有重叠（例如溃疡性结肠炎、克隆病、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻等）［1］。参与核因子 κB（NF-κB）病理通路的人肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（TNFAIP3）相互作用蛋白1（TNIP1）基因在不同人种的多项研究中均有报道，包括中国北方汉族人群［7-8］。为研究TNIP1基因与中国汉族人群相关性，我们选择位于TNIP1基因区域的3个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP），利用连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR）对其进行基因分型，探讨其与寻常性银屑病的相关性。

对象和方法

一、对象

1.研究对象：从内蒙古医科大学附属医院收集寻常性银屑病患者465例，年龄（42.40±17.67）岁，发病年龄（30.91±14.36）岁；男女比例为294/171。健康对照476例，年龄（38.10±16.00）岁，男女比例为225/251。所有研究对象均为汉族人。经知情同意并签字后抽取外周静脉血5 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，置于-80℃冰箱保存备用。所有患者经临床及病理诊断，符合寻常性银屑病诊断标准。健康对照排除银屑病及其他自身免疫疾病，排除银屑病家族史。本研究经过内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准，并在实施过程中遵守赫尔辛基宣言。

2.SNP选择：根据既往文献选择3个SNP（rs17728338、rs3762999和rs999556）进行分型实验［7-9］。

二、方法

1.基因组DNA提取：利用AxyPrep,AP-MX-BLGDNA-25基因组DNA提取试剂盒提取患者及对照基因组DNA，利用分光光度仪检测260和280 nm吸光度，计算DNA浓度。并利用凝胶电泳检测DNA质量，所有DNA样本均合格。

2.引物及探针的合成：利用Primer 3 online（Version 0.4.0）软件（http://frodo.wi.mit.edu/）和 Oligo（Version 6.31）（Molecular Biology Insights Inc.,USA）软件设计特异性引物和LDR探针，针对每个SNP位点设计2条引物，尽量保证所有SNP位点引物的T值相同，PCR引物序列见表1。根据LDR探针设计原则设计LDR的上下游探针［10-11］，上游探针5′端用磷酸化修饰，LDR探针序列见表2。

3.多重 PCR：PCR 反应体系（20 μl）为：1μl模板 ，2 μl 缓冲液 ，0.6 μl Mg2+，2 μl dNTP，0.2 μl TaqDNA聚合酶，2 μl引物混合液，加水补足。PCR反应条件：95℃预变性2min，94℃30s，56℃退火1.5min，65℃30 s，35个循环。最后65℃延伸10 min。

4.多重 LDR：LDR 反应体系 （10 μl） 为：1 μl Buffer缓冲液，1 μl探针混合液，0.05 μl Taq DNA 连接酶，4 μl PCR 产物，加水补足 10 μl。探针混合液浓度为2 μmol/L。LDR反应条件：95℃2 min预变性，94℃ 15 s，50℃ 25 s，进行 40个循环。

表1 针对不同单核苷酸多态性的PCR引物序列

表2 针对不同单核苷酸多态性的连接酶检测反应探针序列

5.测序与基因分型：反应产物经过ABI3730测序仪测序分析，最后用Genemapper软件进行数据分析，判读各位点上各样本的基因分型。

6.统计分析：所有SNP分型数据质控、统计分析利用PLINK 1.07软件完成（http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/）［12］。计算 3 个 SNP 的等位基因频率，在病例组及对照组中分别进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。卡方检验比较病例组及对照组等位基因频率及基因型频率，并计算等位基因的相对危险度估计值比值比OR及其95%可信区间（95%CI）。对3个SNP间进行连锁不平衡检验，计算两两间的r2和D′值。根据患者发病年龄（早发型：发病年龄＜40岁；晚发型：发病年龄≥40岁）及有无银屑病家族史进行分层分析。所有统计检验均为双侧概率检验，根据Bonferroni多重检验校正原理，P＜0.0167（0.05/3）为差异有统计学意义。

结 果

一、样本及SNP质控

病例组及对照组在性别及年龄分布方面差异无统计学意义（均P＞0.05）。3个SNP在病例及对照中均符合Hardy-Weinberg遗传平衡。

二、等位基因频率及基因型频率比较

rs17728338等位基因频率在寻常性银屑病组及各型病例组均显著高于对照组（P＜0.016 7）。rs3762999和rs999556等位基因频率在寻常性银屑病组和对照组间差异未达到Bonferroni校正水平，但是有家族史组显著高于对照组（P＜0.0167）。见表3、4。

在不同遗传模式下比较病例组和对照组间基因型频率，发现在显性遗传模式下，3个SNP的基因型频率在两组间差异有统计学意义，而在隐形遗传模式下差异无统计学意义。分层分析显示，在显性遗传模式下，早发型、晚发型、有家族史、无家族史病例组rs17728338基因型频率与对照组间差异均有统计学意义（均P＜0.016 7）。显性模式下，rs3762999和rs999556基因型频率在有家族史组与对照组间差异有统计学意义（P＜0.016 7）；rs999556基因型频率在早发型病例组与对照组间差异有统计学意义（P=0.01）。见表 5、6。

三、3个SNP间的连锁不平衡分析

rs3762999与rs999556间存在强连锁不平衡（r2=0.91，D′=0.98），rs17728338 与 rs3762999 和rs999556之间有中等程度的连锁不平衡（r2分别为0.37 和 0.35，D′分别为 0.99 和 1.00）。

讨 论

最早Nair等［8］在欧洲人群中发现TNIP1与银屑病的相关性，此后在多项研究中得到证实。2010年Sun等［7］首次报道中国人群中TNIP1与银屑病的相关性，Yang等［9］也得出相同的结果，并且发现rs17728338与关节病性银屑病也具有相关性，其等位基因A的频率在中国人群（0.089）高于欧洲人群（0.056）［7-9］，但根据OR值看出其对疾病的影响均为增加患病风险。我们分层分析发现，rs17728338的基因型频率在早发型、晚发型、有家族史、无家族史寻常性银屑病组与对照组间差异均有统计学意义，而且均显示为显性遗传模式。Sun等［7］除发现rs17728338的相关性外，还发现另外2个位于TNIP1基因区域的SNP（rs3762999和rs999556）与银屑病也具有相关性。在本研究结果中，rs3762999和rs9995562等位基因频率在银屑病组和健康对照中存在差异，但是经过多重检验校正后差异无统计学意义。在不同遗传模式下统计分析，发现在显性遗传模式下这2个SNP的基因型频率在病例组和对照组间差异有统计学意义，并且达到Bonferroni校正水平（P＜0.016 7）。rs3762999和rs9995562基因型频率在有家族史组与对照组间差异有统计学意义。患者发病年龄分层分析显示，只有rs9995562与早发型相关，未发现rs3762999的相关性。这些结果提示，家族史阳性是寻常性银屑病发病的一个明显的易感因素，TNIP1基因多态性对家族史阳性患者发病风险的影响更大，并且这种影响在显性遗传模式下更为显著。查询rs3762999及rs999556在既往研究中的等位基因频率，发现本研究中这2个SNP的等位基因频率与Sun等［7］的报道类似。连锁不平衡分析发现，rs17728338与rs3762999及rs999556两个SNP均具有中等程度的连锁不平衡。以上结果提示这3个SNP可能代表同一个关联信号。

表3 寻常性银屑病患者rs17728338、rs3762999和rs999556等位基因频率分析

表4 寻常性银屑病和对照组中rs17728338、rs3762999和rs999556基因型分布及分层分析

表5 显性模式下寻常性银屑病和对照组中rs17728338、rs3762999和rs999556基因型分布及分层分析

表6 隐性模式下寻常性银屑病和对照组中rs17728338、rs3762999和rs999556基因型分布及分层分析

TNIP1基因位于5q32-q33.1，其信使 RNA（mRNA）广泛表达于外周白细胞、脾脏、骨骼肌及肾脏。编码蛋白A20结合NF-κB抑制蛋白1（ABIN1）与其配体A20蛋白结合参与NF-κB的抑制。TNIP1基因过表达可以通过抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）而抑制 NF-κB 活性［13］。TNIP1 还可以不依赖 A20 而抑制 TNF 介导的细胞凋亡［14-15］。此外涉及 NF-κB 病理通路的其他基因的变异也与银屑病具有关联性，例如禽网状内皮组织增殖病毒癌基因V-Rel同源基因 （REL）［16-17］、核因子 κB 抑制蛋白 α 亚基（NFKB1A）［18-19］及 TNFAIP3［8］。其中 TNIP1 和 TNFAIP3也是多种自免疫相关疾病的易感基因，包括类风湿性关节炎、乳糜泻、溃疡性结肠炎、克隆病、银屑病、系统性红斑狼疮等［20-21］。这些遗传学证据提示，NF-κB病理通路可能是银屑病发病过程中一个重要的环节。最近研究显示，TNFAIP3基因多态性与银屑病患者对TNF拮抗剂的治疗反应相关［22］。是否TNIP1也具有类似作用，还需要进一步研究。

我们通过对TNIP1基因区域rs17728338与rs3762999和rs999556三个SNP进行分型研究，证实其与中国汉族人寻常性银屑病的相关性，更进一步提示TNIP1基因在银屑病发病机制中发挥着重要的作用。但是本研究尚有一些不足之处，第一，本研究基于单个基因的多态性进行关联分析，基因-基因间复杂交互作用未能明确，而庞大的基因网络中相互作用非常广泛和复杂，这些遗传变异与疾病易感性的相关性是否会受到其他基因的影响尚不能确定；第二，这3个多态性并非影响基因表达的功能变异，TNIP1基因多态性如何影响其基因功能以及免疫系统功能，仍需要进一步研究。

［1］Tsoi LC,Spain SL,Knight J,et al.Identification of 15 new psoriasis susceptibility loci highlights the role of innate immunity ［J］.Nat Genet,2012,44（12）:1341-1348.

［2］Ellinghaus E,Ellinghaus D,Stuart PE,et al.Genome-wide association study identifies a psoriasis susceptibility locus at TRAF3IP2［J］.Nat Genet,2010,42（11）:991-995.

［3］丁晓岚,王婷琳,沈佚葳.中国六省市银屑病流行病学调查［J］.中国皮肤性病学杂志,2010,24（7）:598-601.

［4］Elder JT.Genome-wide association scan yields new insights into the immunopathogenesis of psoriasis［J］.Genes Immun,2009,10（3）:201-209.

［5］Zhang X.Genome-wide association study of skin complex diseases［J］.J Dermatol Sci,2012,66（2）:89-97.

［6］Chandran V.The genetics of psoriasis and psoriatic arthritis［J］.Clin Rev Allergy Immunol,2013,44（2）:149-156.

［7］Sun LD,Cheng H,Wang ZX,et al.Association analyses identify six new psoriasis susceptibility loci in the Chinese population［J］.Nat Genet,2010,42（11）:1005-1009.

［8］Nair RP,Duffin KC,Helms C,et al.Genome-wide scan reveals association of psoriasis with IL-23 and NF-kappaB pathways［J］.Nat Genet,2009,41（2）:199-204.

［9］Yang Q,Liu H,Qu L,et al.Investigation of 20 non-HLA（human leucocyte antigen）psoriasis susceptibility loci in Chinese patients with psoriatic arthritis and psoriasis vulgaris［J］.Br J Dermatol,2013,168（5）:1060-1065.

［10］Thomas G,Sinville R,Sutton S,et al.Capillary and microelectrophoretic separations of ligase detection reaction products produced from low-abundant point mutations in genomic DNA［J］.Electrophoresis,2004,25（10-11）:1668-1677.

［11］Yi P,Chen Z,Yu L,et al.Development of a PCR/LDR/capillary electrophoresis assay with potential for the detection of a betathalassemia fetal mutation in maternal plasma ［J］.J Matern Fetal Neonatal Med,2010,23（8）:920-927.

［12］Purcell S,Neale B,Todd-Brown K,et al.PLINK:a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses［J］.Am J Hum Genet,2007,81（3）:559-575.

［13］Verstrepen L,Carpentier I,Verhelst K,et al.ABINs:A20 binding inhibitors of NF-kappa B and apoptosis signaling ［J］.Biochem Pharmacol,2009,78（2）:105-114.

［14］Oshima S,Turer EE,Callahan JA,et al.ABIN-1 is a ubiquitin sensor that restricts cell death and sustains embryonic development［J］.Nature,2009,457（7231）:906-909.

［15］Verstrepen L,Carpentier I,Beyaert R.The biology of A20-binding inhibitors of NF-kappaB activation （ABINs）［J］.Adv Exp Med Biol，2014,809:13-31.

［16］Ali FR,Barton A,Smith RL,et al.An investigation of rheumatoid arthritis loci in patients with early-onset psoriasis validates association of the REL gene［J］.Br J Dermatol,2013,168（4）:864-866.

［17］Genetic Analysis of Psoriasis Consortium&the Wellcome Trust Case Control Consortium 2,Strange A,Capon F,et al.A genomewide association study identifies new psoriasis susceptibility loci and an interaction between HLA-C and ERAP1 ［J］.Nat Genet,2010,42（11）:985-990.

［18］Stuart PE,Nair RP,Ellinghaus E,et al.Genome-wide association analysis identifies three psoriasis susceptibility loci［J］.Nat Genet,2010,42（11）:1000-1004.

［19］Li Y1,Cheng H,Zuo XB,et al.Association analyses identifying two common susceptibility loci shared by psoriasis and systemic lupus erythematosus in the Chinese Han population ［J］.J Med Genet,2013,50（12）:812-818.

［20］Maxwell JR,Gowers IR,Wilson AG.Complex genetic association of 6q23 with autoimmune rheumatic conditions ［J］.Arthritis Res Ther,2009,11（2）:107.

［21］Ramos PS,Criswell LA,Moser KL,et al.A comprehensive analysis of shared loci between systemic lupus erythematosus （SLE）and sixteen autoimmune diseases reveals limited genetic overlap［J/OL］.PLoS Genet,2011,7（12）:e1002406［2011-12-08］.http://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1002406.

［22］Tejasvi T,Stuart PE,Chandran V,et al.TNFAIP3 gene polymorphisms are associated with response to TNF blockade in psoriasis［J］.J Invest Dermatol,2012,132（3 Pt 1）:593-600.