陈彦斌，刘 蓉，蔡冬元，陈己任

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙410128；2.湖南生物机电职业技术学院，湖南 长沙410127）

月月红月季体细胞胚胎植株再生关键技术研究

陈彦斌1，刘 蓉2，蔡冬元2，陈己任1

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙410128；2.湖南生物机电职业技术学院，湖南 长沙410127）

以带1mm叶柄的月季叶片为外植体诱导出胚性愈伤和体细胞胚胎，对月季体细胞胚胎植株再生进行研究。结果表明，月季体细胞胚胎再生与培养基种类、培养基坡度和体细胞胚胎自身类型等密切相关。月季体细胞胚胎在S P/R培养基（含1.0Mg/L 6-BA＋0.05Mg/L N AA＋3.0 Mg/L G A3）上比在EM培养基（含1.0Mg/L 2,4-D+0.1Mg/L T DZ）上能再生出更多小植株,在E P培养基（含3.0Mg/L 2,4-D+0.5Mg/L T DZ）上则逐步褐化死亡；将培养基放置成坡面，有利于体细胞胚胎分化出芽和根，提高植株再生率；在体细胞胚胎的子叶尚未完全开张（呈90°～150°角）前转入倾斜的S P/R培养基可以再生出正常植株，体细胞胚胎子叶充分伸展甚至向外翻转时（大于150°角）再转入倾斜的S P/R培养基，体细胞胚胎则会回到愈伤组织形态，丧失植株再生能力。

月季；体细胞胚胎发生；植株再生；培养基

1967年，Hill报道了现代月季离体培养可成功诱导器官再生[1]，自此以后，有关月季植株离体再生培养的报道越来越多。月季植株再生的途径很多，其中以不定芽为材料诱导器官发生获得再生植株的报道较多。例如：高莉萍和包满珠分别采用直接和间接法诱导不定芽，建立了现代月季——萨曼莎的再生体系[2]；张常青等[3]以地被月季Royal Bassino为材料建立了不定芽高频再生体系；孟令宁等[4]建立了大花香水月季间接器官再生途径；田传卫等[5]建立了多花蔷薇假珠芽再生体系。另外，通过诱导月季体细胞胚胎发生也是获得再生植株的有效途径之一。例如：郭艳超等[6]通过诱导香水月季类原球茎获得了再生植株；郭丽娟等[7]以丰花月季品种——红帽子的叶片为材料，通过体细胞胚胎发生获得了再生植株；尤扬等[8]以黄和平月季的幼嫩叶片为材料诱导体细胞胚胎发生获得了再生植株。鉴于月季在观赏园艺以及香味物质制作中的重要地位，法国、美国、韩国、日本等国的月季体细胞胚胎发生及植株再生研究较多[9-15]。从前人的研究成果不难看出，通过离体培养获取月季再生植株并不容易，尤其是通过体细胞胚胎发生获取再生植株的频率较低[16-17]。

中国月季栽培种——月月红的花大色红，观赏价值较高，在月季育种中占据重要地位，是现代月季始祖之一[18]。前期研究发现培养基pH值、ABA含量和光质3个条件对月月红体细胞胚胎发生及体细胞胚胎类型有显著影响；同时，在体细胞胚胎发生向器官发生转化的过程中发现了介于体细胞胚胎和芽的中间态，这说明体细胞胚胎发生和器官发生可能是同源的[19-20]；另外，研究还发现月月红的植株再生不稳定，再生率的高低与外界条件和自身形态密切相关，以双子叶型体细胞胚胎的再生率最高[21]。由于体细胞胚胎再生为植株是影响基因转化、良种扩繁的关键技术，试验主要对培养基、体细胞胚胎形态等影响体细胞胚胎植株再生的主要因素进行研究，以期进一步优化中国月季的体细胞胚胎植株再生体系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试月季品种为月月红（Rosa.chinensis Jacq.），采自北京林业大学苗圃，以带1mm叶柄的月季叶片为外植体。

供试培养基有SP/R培养基（MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋GA33.0mg/L＋琼脂0.6%，pH值6.0），用于芽分化或再生；EP培养基（SH＋蔗糖3%＋L-脯氨酸300mg/L＋琼脂0.4%＋2,4-D 3.0 mg/L＋TDZ 0.5mg/L，pH值5.4），用于胚胎分化；EM培养基（SH＋2,4-D 1.0 mg/L＋TDZ 0.1 mg/L＋ABA 1.0 mg/L＋GA33.0 mg/L＋蔗糖 3%＋琼脂0.4%，pH值6.0），用于胚胎成熟。白光由实验室白色荧光灯管Philips TLP 36W/840提供；红光由Philips 13W MiniTwister Energy SaverRed bulbs提供。

1.2 实验方法

1.2.1 胚性愈伤组织的诱导 将植株表面消毒后，取长0.5～0.8 cm、带约1mm叶柄的叶片置于优化的EP培养基中培养。培养皿密封后置于暗处培养，每4周更换一次培养基。

1.2.2 胚性愈伤组织的体细胞胚胎发生 将EP培养基上培养12周的胚性愈伤转移到EM培养基中诱导体细胞胚胎发生。光照条件为红光，光强约为7.2 μmol（/m·s）。每4周更换一次培养基。

1.2.3 体细胞胚胎的植株再生 设计3个体细胞胚胎植株再生方案：（1）胚性愈伤组织在EM培养基上培养12周后，选择可见子叶胚的愈伤组织，连同体细胞胚胎一同转到新的EP、EM和SP/R培养基上诱导体细胞胚胎植株再生，每瓶称取可见子叶胚的愈伤组织1 g，每个处理10瓶；（2）用SP/R培养基制备水平和坡面两种固体培养基，水平培养基用普通玻璃培养瓶，坡面培养基用250ML三角瓶，趁热倒入约20ML SP/R培养基，先将三角瓶倾斜放置，使培养基表面几乎与瓶底垂直；各挑选30个子叶胚分别放置于两种培养基上培养，每瓶培养基上放置10个左右，观察其植株再生情况；（3）选取两种不同开张度的“双子叶”型体细胞胚胎，一种是子叶开张度为90°～150°，另一种是子叶呈外卷状，开张度大于180°；两种开张度分别选10个，置于坡面培养基上培养，观察其再生过程；体细胞胚胎植株再生的培养条件相同，为温度25 ±2°C，光照周期为16 h/8 h（L/D），白光照射，光强约为27.0μmol（/m·s），于8～12周观察体细胞胚胎植株再生情况。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对体细胞胚胎植株再生的影响

对带子叶胚的胚性愈伤在EP、EM、SP/R上的分化和再生情况进行了研究，结果表明，在EP培养基和EM培养基上分别培养12周后，部分外植体的叶柄基部逐渐分化出胚性愈伤组织，并分化出带子叶的体细胞胚（图1A）。将这些带子叶胚的胚性愈伤组织分别置于EP、EM和SP/R培养基上，在1～3周，有些体细胞胚胎会进一步分化，伸长子叶，并长出芽。随后，EP培养基上的愈伤组织开始逐渐褐化并死亡（图1Ba）；EM培养基上的愈伤组织也有一定程度的褐化，但能再生出少量正常植株，每克愈伤组织约可以分化出再生植株1～3株（图1Bb）；在EP、EM培养基上的愈伤组织会继续分化出愈伤组织，增加愈伤组织的量；SP/R培养基上的愈伤组织不再增加，原来的愈伤组织逐步分化和再生出正常植株，每克愈伤组织约可以分化出再生植株5～9株（图1Bc）。

图1 胚性愈伤体细胞胚胎发生和在不同培养基上植株再生A为在EM培养基上分化出的体细胞胚胎；B为胚性愈伤组织和体细胞胚胎在E P（a）、EM（b）和S P/R（c）培养基上的再生情况。

2.2 培养基坡度对植株再生的影响

前期研究发现，体细胞胚胎从愈伤组织上脱离下来后，在很长一段时间内不会生长，多数会伸长子叶柄；常规培养时，培养基表面会聚集一些水份，芽点长期浸在培养基表面的水中较难萌发，逐渐长成水渍状，失去生长活力（图2A）。而将培养基做成与瓶底几乎垂直的坡面，培养基表面的水分下溢，体细胞胚胎置于坡面培养基的中间位置，可以像种子胚一样正常生长。子叶先膨大，然后长出芽和根（图2B）。对比发现，在平面培养基上，双子叶型体细胞胚胎的植株再生率只有20%，而在坡面培养基中植株再生率达到63.3%。

图2 脱离愈伤组织的体细胞胚胎在水平和坡面培养基上的分化与植株再生A为脱离愈伤组织的体细胞胚胎在水平S P/R固体培养基上生长8周的状态；B为脱离愈伤组织的体细胞胚胎在坡面S P/R固体培养基上生长1周（a）、2周（b）、7周（c）、9周（d）的状态。

2.3 子叶开张角度对植株再生的影响

前期研究发现，不同光照条件和不同激素浓度对月季体细胞胚胎的形态特征均有影响。不同ABA含量可使月季分化出单子叶、双子叶甚至多子叶型体细胞胚胎。其中，以双子叶体细胞胚胎的再生频率最高。研究进一步发现，子叶的开张角度对植株再生也有显著影响。通过对开张角度较小和开张角度较大的两组双子叶型体细胞胚胎的观察发现，体细胞胚胎子叶开张角度较小，在90°～150°时，可以清楚地看到子叶中间有小孔（图3Aa），能分化出正常芽；当子叶开张角度大于180°时，子叶逐渐外卷，两片子叶中间没有小孔（图3Ba）。在坡面培养基上，子叶开张角度较小的体细胞胚胎的子叶先膨大，并分化出根尖，然后分化出芽点，并迅速生长出芽（图3Ab和c）。子叶开张角度较大且子叶外卷的体细胞胚胎则不一样，它在转入坡面培养基后，首先会在芽点位置和根尖点位置继续长出愈伤组织，随后整个子叶也会长出愈伤组织，完全丧失植株再生能力（图3Bb和c）。

图3 不同开张度体细胞胚胎在坡面培养基上的分化A为子叶开张角度在90°～150°的体细胞胚胎在坡面培养基上像种子胚一样正常分化出芽；B为子叶开张角度大于180°的体细胞胚胎在坡面培养基上会逐步分化成愈伤组织。

3讨论

月季的体细胞胚胎和器官发生已有很多报道，但从文献的连续性报道分析，绝大多数研究者都在做完体细胞胚胎发生以后，未进行后续的如转基因方面的研究，主要原因是月季从体细胞胚胎到植株再生这一过程的条件非常苛刻，再生率低，一般在3%左右，最高的也只有35%左右。晏慧君等[22]以月月红为材料进行植株再生，再生率仅0.15%～0.48%。笔者在前期研究中发现，如果不对月季的体细胞胚胎进行分类，去除不能再生的胚，不严格和正常掌握转移到新培养基的时间，月月红的植株再生率可能还会更低。这严重制约了转基因等新技术在月季种质创新中的应用。

该研究结果表明，首先，以2,4-D诱导胚性愈伤组织产生，当体细胞胚胎子叶形成后要及时替换成不含2,4-D的培养基，如果未及时替换，芽点和根尖点会进一步脱分化成愈伤组织，很难再生出植株；其次，体细胞胚胎发生过程中，根点和芽点不宜长期浸渍在水分和液体营养中，将培养基做成坡面，甚至与瓶底成垂直状态可有效避免水渍状细胞产生，有利于芽点和根尖点进一步分化成再生植株。关于激素和水分营养梯度对月季体细胞胚胎植株再生所起的作用及机理有待进一步深入研究。

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（责任编辑：成 平）

Key Technologies for Plant Regeneration of Somatic Embryos in Rose‘Yueyue Hong’（Rosa chinensis Jacq.）

CHEN Yan-bin1，LIU Rong2，CAIDong-yuan2，CHEN Ji-ren1
（1.College of Horticulture and Gardening,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC; 2.Hunan Biological and Professional technology College,Changsha 410127,PRC）

Leavesw ith a 1mMpetiole of China Rose(R.chinensis Jacq.)were used asexplant to induce embryogenic callus and embryos for study of p lant regeneration of rose.The results show ed that the regeneration of rose somatic embryos was closely related to types of culturemedia,slope ofmediuMand type of embryo itself.The higher regenerated frequency w as obtain on SP/R mediuMcontaining 1.0 mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+3.0mg/LGA3than on EMmediuMw ith 1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L TDZ.Somatic embryoson EPmedia w ith 3.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L TDZwould be browned and subsequently necrosed.The sloping and even verticalmedium,w ith probably differentw ater and nutrition level in differentmediuMheight,was benefit for the proliferation of shoot and root of somatic embryos and showed higher regenerated frequency.Somatic embryos should be transferred to SP/RmediuMfor normal plant regeneration before the cotyledons stretch thoroughly.The somatic embryo w ith cotyledons stretch thoroughly would go back to calli and lose capacity of regeneration on SP/Rmedium.

rose;somatic embryogenesis;plant regeneration;medium

S685.12

A

1006-060X（2015）04-0091-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.029

2015-04-23

国家自然科学基金资助项目（31272208，31071826）；湖南省研究生创新基金资助项目（C X2012B298,X C X13101）

陈彦斌（1988-），男，湖南湘潭市人，硕士研究生，主要从事园艺植物栽培与育种研究。

陈己任