卫 强，纪小影

安徽新华学院药学院，合肥 230088

红叶李［Prunus cerasiferaEhrh.cv.AtropurpureaJacg.］又名紫叶李或樱桃李，是落叶乔木，为蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)李属(Prumus)植物，原产于亚洲，为我国最常用的城市景观植物之一［1］。红叶枝和叶呈褐红，有光泽，花色粉红，深红色果实。以叶色闻名，在整个生长期叶色呈紫红色，尤其春秋两季叶色更艳，且具有较强的耐湿、耐寒力，为园林常用的彩叶树种，极具观赏价值［2，3］。现代研究表明，红叶李枝叶中黄酮类成分含量丰富，以山奈酚较为突出［4］。红叶李叶中红色素可经80%乙醇提取得到，红色素在酸性下稳定，而中性和碱性下不稳定，且不耐热［5］。进一步研究红叶李叶、枝不同方位和部位中花色素含量分布情况表明，朝南方叶、枝优于朝北方，叶中花青素含量优于枝条［6］。

植物多糖具有良好的降血糖、降血脂［7］、抗肿瘤［8］、免疫调节作用［9］和改善学习记忆能力［10］等，目前对红叶李花中多糖的提取和单糖组成研究鲜有报道。植物细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质等物质构成的致密结构，多糖成分与维生素、蛋白质、果胶、淀粉、植物纤维等成分共存，普通提取难以破壁溶解，提取率较低［11］。酶解作用可破坏细胞壁致密结构，使细胞壁组织水解，打开胞内成分溶出的屏障，解决多糖的溶出问题。闪式技术也具有高效破壁功能，酶法与闪式联合使用可有效发挥破壁功能，大大提高对多糖的提取效能。本文对红叶李花中多糖类成分进行酶法和闪式提取，以DEAE-52 纤维素柱和Sephadex G-150 进行分离纯化得到多糖的组分，对多糖组分进行乙酰化，以气相色谱-质谱(GCMS)初步分析其单糖组成，可为其多糖进一步开发应用提供基础。

1 材料与仪器

红叶李花采自合肥大蜀山区，经安徽新华学院李启照副教授鉴定为蔷薇科植物红叶李(Prunus cerasiferaEhrh.cv.AtropurpureaJacg.)的花。复合酶(其中纤维素酶5000 IU/g、酸性蛋白酶2000 IU/g、果胶酶2000 IU/g、木聚糖酶5000 IU/g，宁夏夏盛实业集团有限公司)。鼠李糖(批号:111668-200602)、阿拉伯糖(批号:111506-200001)、木糖(批号:111508-200404)、甘露糖(批号:140651-200602)、葡萄糖(批号:110833-201205)、半乳糖标准品(批号:100226-201105)(中国药品生物制品鉴定院，含量均为98%以上)，其它试剂均为分析纯，水为纯化水。

JHBE-50 型闪式提取器(河南金鼎科技发展有限公司);LDZ4-1.2 型低速离心机(北京京立离心机有限公司);KJ-SY-150 超声提取器(北京同德创业科技有限公司);CNWB-C 型微波萃取器(广州万程微波设备有限公司);UV-4802 型紫外-可见分光光度计(美国尤尼柯仪器有限公司);Agilent 6890-5973N 气相色谱仪(美国安捷伦公司);FA1004 型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 提取方法

2.1.1 酶法联合煮沸提取

精密称取干燥红叶李花粗粉5 g 两份，一份置于于500 mL 具塞锥形瓶中，加入100 mL 蒸馏水浸泡12 h，再加入0.1%的植物复合酶35 ℃酶解2 h，再加入200 mL 蒸馏水煮沸提取2 h。另一份不加酶，直接加入300 mL 蒸馏水同前煮沸提取。

2.1.2 酶法联合超声提取

精密称取干燥红叶李花粗粉5 g 两份，一份同2.1.1 酶解后，再加入200 mL 蒸馏水超声提取30 min，超声功率2 kW。另一份不加酶，直接加入300 mL 蒸馏水同前超声提取。

2.1.3 酶法联合微波提取

精密称取干燥红叶李花粗粉5 g 两份，一份同2.1.1 酶解后，再加入200 mL 蒸馏水微波提取5 min，微波功率2 kW。另一份不加酶，直接加入300 mL 蒸馏水同前微波提取。

2.1.4 酶法联合闪式提取

精密称取干燥红叶李花粗粉5 g 两份，一份同2.1.1 酶解后，再加入200 mL 蒸馏水闪式提取3 min，功率2 kW。另一份不加酶，直接加入300 mL蒸馏水同前闪式提取。

上述提取方法均重复3 次，每次提取液均减压回收至约100 mL，以石油醚萃取、Sevag 法除蛋白，取少量样品过0.45 μm 滤膜，稀释适当倍数按照2.2 项下测定多糖含量。

2.2 多糖含量测定

［12］，精密称取20.56 mg 葡萄糖标准品，以蒸馏水定容于100 mL 容量瓶。精密移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL 葡萄糖标准品溶液，置于8 只10 mL 刻度试管中，分别加入蒸馏水至2 mL，再分别加入1.0 mL 的5%的苯酚溶液及7 mL 的浓硫酸溶液，摇匀，水浴加热25 min，冷却至室温，以去离子水为空白对照，在490 nm 下测定吸光度，以吸光度A1为纵坐标，葡萄糖浓度C1为横坐标，绘制标准曲线A1=0.0036C1-0.0024，线性范围为0～16.45 μg/mL，测定样品总糖得率。

分别精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL 葡萄糖标准品溶液，置于10 mL 刻度试管中，分别加入蒸馏水定容至4 mL，再分别加入5 mL浓度为6.5 mg/mL 的二硝基水杨酸(DNS)溶液，摇匀，沸水浴中加热5 min，冷却至室温，蒸馏水定容至10 mL，于540 nm 波长下测定吸光度，以吸光度A2为纵坐标，葡萄糖浓度C2为横坐标，绘制标准曲线A2=0.0049C2-0.0042，线性范围为0～16.45 μg/mL，测定样品还原糖得率。多糖得率计算公式为:

2.3 单因素实验

因酶解与提取为两个不同的处理过程，涉及因素多，为了简化实验流程，将单因素实验分成单因素实验一和单因素实验二分别考察。

2.3.1 单因素实验一

设定闪式提取因素(提取时间2 min，液料比20倍，转速2000 rpm)，当酶解2 h 和酶用量0.10%时，研究酶解温度(15、25、35、45、55、60 ℃)的多糖得率;当酶解温度35 ℃和酶用量0.10%时，研究酶解时间(0.5、1、2、3、4、5 h)的多糖得率;当酶解温度35 ℃和酶解时间3 h 时，研究酶用量(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3%)的多糖得率。

2.3.2 单因素实验二

设定酶解因素(酶解温度45 ℃、酶解时间2 h，酶加入量0.17%)，当液料比20 倍，转速2000 rpm时，研究提取时间(1、2、3、4、5、6 min)的多糖得率;当提取时间4 min，转速2000 rpm 时，研究不同液料比(10，20，30，40，50，60 倍)的多糖得率;当提取时间4 min，液料比40 倍时，考察不同转速(1000、2000、3000、4000、5000、6000 rpm)的多糖得率。

2.4 响应面分析

以Design-Expert 8.0.6 统计软件进行Box-Behnken 中心组合实验设计和分析。见表1。

表1 酶法提取响应面因素及水平Table 1 Factors and levels of the enzymatic extraction of polysaccharides

2.5 多糖的单糖组分分析

将红叶李花提取总多糖以蒸馏水溶解配制成浓度为120 mg/mL 的溶液，离心后取上清液1 mL 上DEAE-52 纤维素柱(1.5 cm ×60 cm)，以蒸馏水及0.1、0.2、0.4、0.6 mol/L 氯化钠溶液依次洗脱，流速为0.5 mL/min，每管收集量为3 mL，于490 nm 处以苯酚-硫酸测定吸光度，绘制洗脱曲线。洗脱液浓缩，再经透析、浓缩、干燥，得红叶李花粗多糖(简称PCS)。多糖溶解于5 mL 蒸馏水中，离心得上清液过Sephadex G-150 凝胶柱，用蒸馏水进行洗脱，苯酚-硫酸法跟踪测吸光值，绘制洗脱曲线，按照洗脱峰收集合并组分，透析冷冻干燥得精多糖Ⅰ(简称PPCS-Ⅰ)和精多糖Ⅱ(简称PPCS-Ⅱ)。

衍生化处理:称取精多糖Ⅰ、精多糖Ⅱ和等量的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖标准品分别加入蒸馏水溶解，加入硼氢化钠还原3 h，以冰乙酸调pH 4～5，加入甲醇，浓缩至干。加入醋酐，90 ℃下水浴1.5 h，冷却，加入甲苯3 mL，N2吹干，加入乙醇，反复吹干3 次后，2 mL 三氯甲烷萃取，过滤得乙酰化产物。

GC-MS 条件:气相色谱配毛细管管柱(HP-5，30×0.32 mm ×0.25 μm);氮气，流速1 mL/min。进样量1 μL;程序升温:柱初始温度160 ℃，以6 ℃/min升至200 ℃，保持6 min;进样口和检测器温度均为250℃。质谱条件:EI 电离源，电离电压70 eV;离子源温度250 ℃;扫描范围:m/z 30～600;分流比:30∶1。

3 结果与分析

3.1 提取方法

由表2 可知，酶处理前煮沸法、超声、微波和闪式提取的平均提取率为5.14 ±0.75%，加酶后平均提取率提高至7.20 ±0.52%，可见酶处理对多糖得率有较大贡献。从酶处理和提取方式的结合角度考虑，酶法联合闪式提取多糖得率最高，提取率达到7.98%。

表2 不同提取方法提取多糖的比较(± s，n=3)Table 2 Comparison of different extraction methods(± s，n=3)

表2 不同提取方法提取多糖的比较(± s，n=3)Table 2 Comparison of different extraction methods(± s，n=3)

3.2 单因素实验

图1 酶解温度(a)、酶解时间(b)、酶用量(c)、提取时间(d)、料液比(e)及转速(f)对多糖得率的影响Fig.1 Effects of enzymatic temperature (a)，enzymatic time (b)，enzyme dosage (c)，extraction time (d)，liquid-solid ratio (e)and speed of revolution (f)on polysaccharides yield

结果见图1(a～f)。由图1a 可知，随着酶解温度的提高，多糖得率逐步提高，但温度高于45 ℃，可导致酶解迅速，性能下降，故酶解温度在35～45 ℃为宜。图1b 显示，酶解2～3 h 有利于发挥最佳酶解效果。图1c 显示，随着酶用量加大，多糖得率逐步提高，酶用量＞0.20%时多糖得率几乎不变，以0.15%～0.20%为宜。图1d 显示，随着提取时间的增加，多糖得率逐步提高，但提取时间＞4 min 时多糖得率反而略有下降，这可能与瞬间产生的热能对成分影响有关。图1e 显示，随着液料比倍数的增加，多糖得率显著增加，以30～40 倍为宜。图1f 显示，随着转速的增加，多糖得率持续增加，但转速＞4000 rpm 时增加缓慢，考虑到能耗因素，以3000～4000 rpm 较合适。

3.3 响应面分析

3.3.1 酶法响应面设计与结果

在单因素实验基础上，选择酶解温度、酶解时间和酶加入量三个因素进行Box-Behnken 中心实验设计，实验结果见表2、3、4 和图2(a～c)。

表3 酶法响应面分析设计及实验结果Table 3 Design and results of response surface methodology of the enzymatic extraction

表4 酶法回归分析结果Table 4 The results of variance analysis of the enzymatic extraction

由表4 可知，A、B、C三个因素，AB、AC、BC交互因素和B2、C2二次响应面模型效果极显著(P＜0.01)，表明三个因素及其交互作用对红叶李花多糖得率均有显著影响。由图2a 可知，酶解时间在2 min 和酶解温度在35 ℃时多糖得率较低，随着时间的延长，温度的提高，多糖得率逐步提高。但提取时间过长，温度过高反而会降低多糖得率。由图2b 可知，随着酶用量加大和酶解时间延长，多糖得率呈现平稳增长，又平稳下降的趋势，表明两者交互作用相对较弱。由图2c 可知，随着酶用量增加和酶解温度提高，多糖得率呈现大幅度增加，后又明显下降，提示两者交互作用明显。说明酶用量需要与温度协调，达到酶解细胞壁的临界点，同时不致水解多糖结构，才能提高提取效果。

对模型进行优化，得回归方程为:

优化后模型R2=0.9993，失拟向检验(lack offit)P值为0.8785，不显著，表明模型充分拟合。以软件Expert-design 8.0 预测酶法最佳工艺为:酶解温度为45 ℃，酶解时间为2 h，酶用量为0.17%。

图2 酶解时间和酶解温度(a)、酶用量和酶解时间(b)、酶用量和酶解温度(c)、液料比和提取时间(d)、转速和提取时间(e)及转速和液料比(f)对多糖得率影响的响应曲面图Fig.2 Response surface plots showing mutual effects of enzymatic time and enzymatic temperature (a)，enzyme dosage and enzymatic time (b)，enzyme dosage and enzymatic temperature (c)，liquid-solid ratio and extraction time (d)，speed of revolution and extraction time (e)as well as speed of revolution and liquid-solid ratio (f)

3.3.2 闪式提取响应面设计与结果

选择3.3.1 最佳工艺优化结果进行酶解。同时在单因素实验基础上，选择提取时间、液料比和转速三个因素进行Box-Behnken 中心实验设计，实验结果见表5～7 和图2(d～f)。

表5 闪式提取响应面因素及水平Table 5 Factors and levels of the smashing tissue extraction

表6 闪式提取响应面分析设计及实验结果Table 6 Design and results of response surface methodology of smashing tissue extraction

表7 闪式提取回归分析结果Table 7 The results of variance analysis of the smashing tissue extraction

由表7 可知，X、XY、YZ、X2、Y2、Z2对多糖得率影响极显著(P＜0.01)由图2d 和2e 可知，提取时间在3～4 min 内多糖得率呈现快速增加，快速降低的趋势，而液料比在30～40 倍和转速在3000～4000 rpm 范围内曲面较平直，对多糖提取影响较小。说明在所选的液料比和转速范围内均可显著提升对多糖的提取，而提取时间不宜过长。由图2f 分析可知，随着液料比倍数和转速的增加，多糖得率平稳增加，且两个因素对多糖提取影响相近，交互作用显著。

对模型进行优化，得回归方程为:

优化后模型R2=0.9995，失拟向检验P值为0.9805，不显著，表明模型充分拟合。以软件Expert-design 8.0 预测酶法最佳工艺为:提取时间为3 min，液料比35 倍，转速为3000 rpm。

3.3.3 验证性实验

对实验模型进行分析，得出红叶李花多糖提取最优工艺参数为:酶解温度为45 ℃，酶解时间为2 h，酶用量为0.17%，闪式提取时间为3 min，液料比35 倍，转速为3000 rpm。多糖得率理论值为13.10%。以上述条件进行工艺验证实验，测得多糖得率实际值为13.02%(n=3，RSD=1.01%)，与理论预测值相比，相对偏差较小，说明工艺稳定。

3.4 多糖的单糖组分分析

如图3a 所示，红叶李花多糖经DEAE-52 柱层析，得到两个峰，表明多糖由两种不同组成的组分构成。如图3b 和3c，利用SephadexG-150 层析柱对组分进一步分离纯化，均出现单一狭窄的对称峰，得到PPCS-I 和PPCS-II 两种多糖组分纯品。

图3 DEAE-52 纤维素柱洗脱(a)、Sephadex G-150 洗脱得PPCS-Ⅰ(b)及Sephadex G-150 洗脱得PPCS-Ⅱ(c)的洗脱曲线Fig.3 Elution curves of DEAE-52 cellulose column chromatography (a)，PPCS-Ⅰby Sephadex G-150 (b)and PPCS-Ⅱby Sephadex G-150 (c)

由图4a 对照可知，图4b 显示PPCS-I 由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖构成，摩尔比为12.11∶3.16∶7.06∶1∶4.92，图4c 显示PPCS-II 由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩尔比为5.02∶1∶13.65∶11.76∶8.39。

图4 单糖标准品(a)、PPCS-I(b)及PPCS-II(c)的GC-MS 总离子图Fig.4 GC-MS total ion chromatograms of standard monosaccharide (a)，PPCS-I (b)and PPCS-II (c)

4 结论

多糖分子量大，结构复杂，且与蛋白质、鞣质等大分子共存，提取难度大。采用酶法与闪式联合提取方法，既可以达到快速破壁的效果，又避免了高温对糖链和结构的破坏。其最佳工艺条件为:酶解温度为45 ℃，酶解时间为2 h，酶用量为0.17%，闪式提取时间为3 min，液料比35 倍，转速为3000 rpm。多糖实际得率达到13.02%。由DEAE-52 纤维素柱和Sephadex G-150 分离纯化，对PPCS-I 和PPCS-II纯品进行GC-MS 分析，得到其单糖组成和比例分别为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖(12.11∶3.16∶7.06∶1∶4.92)，鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖(5.02∶1∶13.65∶11.76∶8.39)。本文为红叶李花中多糖的进一步研究和开发提供了基础。

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