危晴+杨国伟+苏东海+陈亮

摘要：采用超声波辅助萃取法提取，高效液相色谱法测定了锁阳（Cynomorium songaricum）中的熊果酸含量。在单因素试验基础上，以乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率为研究对象，进行了4因素3水平正交试验。结果表明，熊果酸在4.0～16.0 μg/μL范围内呈良好线性关系，回归方程为y=622.7x-85.517，r=0.999 8，加样回收率为98.08%。锁阳中熊果酸最佳提取工艺为：超声功率150 W，料液比1∶25，85%（V/V，下同）乙醇超声提取30 min，在此条件下，锁阳中熊果酸含量为1.53%。该工艺能有效提取锁阳中熊果酸，为评价中药材中的熊果酸水平提供参考。

关键词：锁阳（Cynomorium songaricum）;熊果酸;超声提取;高效液相色谱

中图分类号：TS201.2        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）12-2894-04

Ultrasonic Extraction and HPLC Determination of Ursolic Acid in Cynomorium songaricun

WEI Qing，YANG Guo-wei，SU Dong-hai，CHEN Liang

（Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China）

Abstract：Ursolic acid in Cynomorium songaricum was ultrasonically extracted and detected by HPLC. According to single-factor experiments，three levels of four factors including ethanol concentration，material-liquid ratio，ultrasonic time， and ultrasonic power were selected for the orthogonal design.The results showed that the calibration curve of ursolic acid was linear （r=0.999 8） in the range of 4.0～16.0 μg/μL.The equation was y=622.7x-85.517，r=0.999 8，and recovery was 98.08%.The optimum extraction was carried out in 85%（V/V） ethanol for 30 min with the ultrasonic power of 150 W，and the material-liquid ratio 1∶25.Under the optimal conditions，the content of ursolic acid was 1.53%.The method can extract ursolic acid efficiently，and provide a reference for evaluation ursolic acid in medicinal materials.

Key words：Cynomorium songaricum;ursolic acid;ultrasonic extraction; HPLC

锁阳（Cynomorium songaricum）是一种稀有名贵中草药，俗称“不老药”，是锁阳科锁阳属的单科单属单种植物[1，2]，含有多种药用成分，例如：有机酸、黄酮类、氨基酸等[3-6]，具有抗肿瘤、降低血糖等作用[7]。锁阳中的熊果酸（ursolic acid）又名乌索酸、乌苏酸，是存在于天然植物中的一种三萜类化合物[8]，具有保肝、抗肿瘤、降血脂等作用[9]。熊果酸主要通过酶法辅助法[10]、有机溶剂萃取法[11]、大孔树脂吸附法[12]、超临界萃取法[13]、超声辅助[14]等方法提取;采用分光光度法[15，16]、高效液相色谱法[17]、近红外光谱测定法[18]、薄层扫描[19]等方法测定。

本试验以锁阳为原料，采用超声辅助醇法提取锁阳中熊果酸，以乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率为因素，通过单因素和正交试验确定最佳提取工艺，旨在为锁阳中熊果酸的进一步开发利用提供试验基础和科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料

锁阳产自甘肃省张掖平西湖地区。

1.2  仪器与试剂

1100型高效液相色谱仪（Agilent，美国）;AR2140型电子分析天平（上海奥豪斯国际贸易有限公司）;4000型旋转蒸发器（海道尔夫，德国）;SHB-II循环式真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;恒温水浴锅HH-S（江苏省金坛市医疗仪器厂）;粉碎机（瑞安市百信药机器械厂）;电热恒温鼓风干燥箱（上海苏达实验仪器有限公司）;标准筛（新乡市三圆堂机械有限公司）;KQ250DE数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。熊果酸标准品（中国药品生物制品检定所）;甲醇为色谱纯，无水乙醇为分析纯，去离子水。

1.3  方法

1.3.1  色谱条件  Atlantis C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为水-甲醇（10∶90，V/V），流速为0.8 mL/min，检测波长205 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。

1.3.2  熊果酸标准曲线的绘制  称取105 ℃干燥至恒重的熊果酸标准品20.0 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制0.80 μg/μL的标准溶液。分别吸取不同体积的标准溶液5～20 μL，甲醇定容至10 mL，进样并测定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算线性回归方程。endprint

1.3.3  熊果酸的提取与分析  称取5 g锁阳粉末样品（粉碎机粉碎，过40目筛），按照1∶40（m/V，下同）加入氯仿回流3 h脱脂，回收溶剂，残渣挥干。用85%乙醇（V/V，下同）按20∶1液固比浸泡残渣24 h后，超声波提取45 min，离心得提取液，滤渣重复提取1次，合并提取液减压浓缩，取出残留液，甲醇定容至25 mL。取样品过0.45 μm微孔滤膜后，在上述色谱条件下测定熊果酸的含量

1.3.4  锁阳中熊果酸提取的单因素试验  ①乙醇体积分数。称取1 g脱脂锁阳样品，按照料液比1∶20准确加入70%～95%乙醇溶液，超声功率150 W，超声45 min后，参照“1.3.1”和“1.3.3”分析;②料液比。称取1 g脱脂锁阳样品，按不同料液比（1∶5～1∶30）加入85%乙醇溶液，超声功率150 W，超声时间45 min，后续步骤同①;③超声时间。称取1 g脱脂锁阳样品，料液比1∶20，乙醇浓度85%，超声功率150 W，选取超声波辅助提取的时间为10～60 min，离心取上清液，后续步骤同①;④超声功率。称取1 g脱脂锁阳样品，乙醇体积分数为85%，料液比1∶20，超声时间40 min，超声波功率选择50～300 W，后续步骤同①。

1.3.5  正交试验  在单因素试验基础上，综合考虑多因素相互作用对锁阳熊果酸提取的影响，根据单因素试验结果，采用L9（34）正交设计。

2  结果与讨论

2.1  色谱分析结果

标准品和样品提取液中熊果酸色谱图分别见图1和图2。在该条件下，熊果酸可有效分离。

2.2  单因素试验

单因素试验结果见图3～图6。

由图3可知，乙醇体积分数为85%时，熊果酸含量最大;随着乙醇体积分数增大，含量呈下降趋势。主要原因是乙醇体积分数增大会导致过多的醇溶物质与熊果酸竞争，导致提取的熊果酸含量下降。

由图4可知，随着料液比增大，熊果酸含量逐渐增大，当料液比为1∶20时，熊果酸含量最大;随着料液比增大，熊果酸含量呈下降趋势。主要原因是随着料液比增大，锁阳中其他成分溶解的几率增大，同时延长了后续的浓缩过程，造成熊果酸的损失。

由图5可知，当超声40 min时，熊果酸含量最大。随着超声时间的延长，过多的醇溶物质与熊果酸竞争，影响了熊果酸的提取率，造成含量下降。

由图6可知，超声功率为150 W时，熊果酸含量达到最大;但过强的超声波机械剪切力，破坏了熊果酸的结构，导致熊果酸含量下降。

2.3  正交试验

在单因素试验基础上，设计乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率的4因素3水平正交试验，因素水平见表1，正交试验结果见表2。

由表2极差分析可知，影响熊果酸提取效率的主次因素分别为料液比、乙醇体积分数、超声功率、超声时间。最佳提取工艺为A2B3C1D2，即乙醇体积分数为85%、料液比1∶25、超声时间30 min、超声功率150 W，在此组合下，获得样品中的熊果酸可达1.53%。

2.4 方法评价

吸取标准品10 μL，重复进样6次，求得峰面积RSD为1.39%，表明仪器精密度良好。

吸取标准品10 μL，进样，分别于0～6 h，每间隔0.5 h重复上述操作，求得峰面积RSD为1.9%，结果表明标准品溶液在6 h内基本稳定。

吸取已知浓度的供试品溶液500 μL，加入0.80 mg/mL的熊果酸标准品溶液500 μL，混匀，进样10 μL，平行测定3次，求得熊果酸平均回收率为98.08%。

称取已知浓度的同一样品6份，依次分别制得样品溶液，精密吸取样品溶液10 μL，进样，求得峰面积RSD为1.9%。

3  结论

锁阳中熊果酸在4.0～16.0 μg/μL范围内线性关系良好（r=0.999 8），其回归方程为y=622.7x-85.517，r=0.999 8。精密度RSD为1.39%，加样回收率平均为98.08%，RSD为1.9%。熊果酸提取的最佳工艺条件是：乙醇体积分数为85%、料液比1∶25、超声时间30 min、超声功率150 W，锁阳中熊果酸的含量约为1.53%。该方法提取锁阳中的熊果酸含量较高，可为开发利用相关药材提供参考。

参考文献：

[1] 陈圆华，谢志兵，董静洲.锁阳综合研究概况[J].经济林研究，2005，23（4）：114-117.

[2] 王  勤，孙  芸.HPLC法测定锁阳中没食子酸和原儿茶酸的含量[J].西北药学杂志，2010，25（3）：190-192.

[3] 薛国庆，刘  青，任雪峰，等.火焰原子吸收光谱法测定锁阳中15种金属元素含量[J].光谱学与光谱分析，2004，24（11）：345-347

[4] 姚  健，牛世全，达文燕，等.锁阳酿酒成分分析[J].西北师范大学学报（自然科学版），2001，37（2）：73-75.

[5] 苏格尔，常艳旭.锁阳中的化学成分及药理作用研究概况[J].中国民族医药杂志，2005，12（6）：46-49.

[6] 韩多红，孟红梅，张  勇.“沙漠人参”锁阳植物资源的研究和开发利用[J].中国野生植物资源，2003，22（4）：45-46.

[7] 齐艳华，苏格尔.锁阳的研究进展[J].中草药，2000，31（2）：146-148.

[8] 李华荣，孙  鑫.熊果酸含量测定方法研究进展[J].时珍国医国药，2010，21（6）：1564-1565.

[9] 孟艳秋，陈  瑜，王  趱，等.熊果酸的研究进展[J].中国新药杂志，2007，16（1）：25-28.

[10] 张  利，何林芯，冯喜文，等.酶法提取车前草中熊果酸的工艺研究[J].安徽农业科学，2010，38（11）：5846-5847.

[11] 梁振益，王  军，陈祎平，等.迷迭香中熊果酸的提取工艺研究[J].时珍国医国药，2010，21（11）：2806-2808.

[12] 姚  干，何宗玉，闫光凡，等.大孔吸附树脂纯化女贞子中齐墩果酸和熊果酸的研究[J].中草药，2007，38（10）：1498-1501.

[13] 袁  珂，孙  伟，张晓明.超临界二氧化碳萃取冬凌草中熊果酸的研究[J].林产化学与工业，2006，26（2）：131-134.

[14] 袁  珂，杨中汉.车前草中熊果酸的超声提取及高效液相色谱法测定[J].时珍国医国药，2006，17（12）：2466-2467.

[15] 李国章，于华忠，卜晓英，等.分光光度法测定湘产苦丁茶中熊果酸含量[J].光谱实验室，2006，23（2）：401-404.

[16] 莫峥嵘，王安伟，莫燕琴，等.青梅茎中总三萜酸的含量测定[J].时珍国医国药，2008，19（11）：2580-2581.

[17] 危华玲，李  徽，卢文胜.高效液相色谱法测定复方黄酮胶囊中熊果酸的含量[J].时珍国医国药，2007，18（10）：2395-2396.

[18] 宋丽丽，范丙义，徐晓杰，等.近红外光谱法用于六味地黄丸模拟样品中熊果酸的含量测定[J].中国中药杂志，2006，31（19）：1590-1593.

[19] 邱  震，周家才.薄层扫描法测定左归丸中熊果酸含量[J].安徽医药，2008，12（8）：698-699.endprint

1.3.3  熊果酸的提取与分析  称取5 g锁阳粉末样品（粉碎机粉碎，过40目筛），按照1∶40（m/V，下同）加入氯仿回流3 h脱脂，回收溶剂，残渣挥干。用85%乙醇（V/V，下同）按20∶1液固比浸泡残渣24 h后，超声波提取45 min，离心得提取液，滤渣重复提取1次，合并提取液减压浓缩，取出残留液，甲醇定容至25 mL。取样品过0.45 μm微孔滤膜后，在上述色谱条件下测定熊果酸的含量

1.3.4  锁阳中熊果酸提取的单因素试验  ①乙醇体积分数。称取1 g脱脂锁阳样品，按照料液比1∶20准确加入70%～95%乙醇溶液，超声功率150 W，超声45 min后，参照“1.3.1”和“1.3.3”分析;②料液比。称取1 g脱脂锁阳样品，按不同料液比（1∶5～1∶30）加入85%乙醇溶液，超声功率150 W，超声时间45 min，后续步骤同①;③超声时间。称取1 g脱脂锁阳样品，料液比1∶20，乙醇浓度85%，超声功率150 W，选取超声波辅助提取的时间为10～60 min，离心取上清液，后续步骤同①;④超声功率。称取1 g脱脂锁阳样品，乙醇体积分数为85%，料液比1∶20，超声时间40 min，超声波功率选择50～300 W，后续步骤同①。

1.3.5  正交试验  在单因素试验基础上，综合考虑多因素相互作用对锁阳熊果酸提取的影响，根据单因素试验结果，采用L9（34）正交设计。

2  结果与讨论

2.1  色谱分析结果

标准品和样品提取液中熊果酸色谱图分别见图1和图2。在该条件下，熊果酸可有效分离。

2.2  单因素试验

单因素试验结果见图3～图6。

由图3可知，乙醇体积分数为85%时，熊果酸含量最大;随着乙醇体积分数增大，含量呈下降趋势。主要原因是乙醇体积分数增大会导致过多的醇溶物质与熊果酸竞争，导致提取的熊果酸含量下降。

由图4可知，随着料液比增大，熊果酸含量逐渐增大，当料液比为1∶20时，熊果酸含量最大;随着料液比增大，熊果酸含量呈下降趋势。主要原因是随着料液比增大，锁阳中其他成分溶解的几率增大，同时延长了后续的浓缩过程，造成熊果酸的损失。

由图5可知，当超声40 min时，熊果酸含量最大。随着超声时间的延长，过多的醇溶物质与熊果酸竞争，影响了熊果酸的提取率，造成含量下降。

由图6可知，超声功率为150 W时，熊果酸含量达到最大;但过强的超声波机械剪切力，破坏了熊果酸的结构，导致熊果酸含量下降。

2.3  正交试验

在单因素试验基础上，设计乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率的4因素3水平正交试验，因素水平见表1，正交试验结果见表2。

由表2极差分析可知，影响熊果酸提取效率的主次因素分别为料液比、乙醇体积分数、超声功率、超声时间。最佳提取工艺为A2B3C1D2，即乙醇体积分数为85%、料液比1∶25、超声时间30 min、超声功率150 W，在此组合下，获得样品中的熊果酸可达1.53%。

2.4 方法评价

吸取标准品10 μL，重复进样6次，求得峰面积RSD为1.39%，表明仪器精密度良好。

吸取标准品10 μL，进样，分别于0～6 h，每间隔0.5 h重复上述操作，求得峰面积RSD为1.9%，结果表明标准品溶液在6 h内基本稳定。

吸取已知浓度的供试品溶液500 μL，加入0.80 mg/mL的熊果酸标准品溶液500 μL，混匀，进样10 μL，平行测定3次，求得熊果酸平均回收率为98.08%。

称取已知浓度的同一样品6份，依次分别制得样品溶液，精密吸取样品溶液10 μL，进样，求得峰面积RSD为1.9%。

3  结论

锁阳中熊果酸在4.0～16.0 μg/μL范围内线性关系良好（r=0.999 8），其回归方程为y=622.7x-85.517，r=0.999 8。精密度RSD为1.39%，加样回收率平均为98.08%，RSD为1.9%。熊果酸提取的最佳工艺条件是：乙醇体积分数为85%、料液比1∶25、超声时间30 min、超声功率150 W，锁阳中熊果酸的含量约为1.53%。该方法提取锁阳中的熊果酸含量较高，可为开发利用相关药材提供参考。

参考文献：

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[4] 姚  健，牛世全，达文燕，等.锁阳酿酒成分分析[J].西北师范大学学报（自然科学版），2001，37（2）：73-75.

[5] 苏格尔，常艳旭.锁阳中的化学成分及药理作用研究概况[J].中国民族医药杂志，2005，12（6）：46-49.

[6] 韩多红，孟红梅，张  勇.“沙漠人参”锁阳植物资源的研究和开发利用[J].中国野生植物资源，2003，22（4）：45-46.

[7] 齐艳华，苏格尔.锁阳的研究进展[J].中草药，2000，31（2）：146-148.

[8] 李华荣，孙  鑫.熊果酸含量测定方法研究进展[J].时珍国医国药，2010，21（6）：1564-1565.

[9] 孟艳秋，陈  瑜，王  趱，等.熊果酸的研究进展[J].中国新药杂志，2007，16（1）：25-28.

[10] 张  利，何林芯，冯喜文，等.酶法提取车前草中熊果酸的工艺研究[J].安徽农业科学，2010，38（11）：5846-5847.

[11] 梁振益，王  军，陈祎平，等.迷迭香中熊果酸的提取工艺研究[J].时珍国医国药，2010，21（11）：2806-2808.

[12] 姚  干，何宗玉，闫光凡，等.大孔吸附树脂纯化女贞子中齐墩果酸和熊果酸的研究[J].中草药，2007，38（10）：1498-1501.

[13] 袁  珂，孙  伟，张晓明.超临界二氧化碳萃取冬凌草中熊果酸的研究[J].林产化学与工业，2006，26（2）：131-134.

[14] 袁  珂，杨中汉.车前草中熊果酸的超声提取及高效液相色谱法测定[J].时珍国医国药，2006，17（12）：2466-2467.

[15] 李国章，于华忠，卜晓英，等.分光光度法测定湘产苦丁茶中熊果酸含量[J].光谱实验室，2006，23（2）：401-404.

[16] 莫峥嵘，王安伟，莫燕琴，等.青梅茎中总三萜酸的含量测定[J].时珍国医国药，2008，19（11）：2580-2581.

[17] 危华玲，李  徽，卢文胜.高效液相色谱法测定复方黄酮胶囊中熊果酸的含量[J].时珍国医国药，2007，18（10）：2395-2396.

[18] 宋丽丽，范丙义，徐晓杰，等.近红外光谱法用于六味地黄丸模拟样品中熊果酸的含量测定[J].中国中药杂志，2006，31（19）：1590-1593.

[19] 邱  震，周家才.薄层扫描法测定左归丸中熊果酸含量[J].安徽医药，2008，12（8）：698-699.endprint

1.3.3  熊果酸的提取与分析  称取5 g锁阳粉末样品（粉碎机粉碎，过40目筛），按照1∶40（m/V，下同）加入氯仿回流3 h脱脂，回收溶剂，残渣挥干。用85%乙醇（V/V，下同）按20∶1液固比浸泡残渣24 h后，超声波提取45 min，离心得提取液，滤渣重复提取1次，合并提取液减压浓缩，取出残留液，甲醇定容至25 mL。取样品过0.45 μm微孔滤膜后，在上述色谱条件下测定熊果酸的含量

1.3.4  锁阳中熊果酸提取的单因素试验  ①乙醇体积分数。称取1 g脱脂锁阳样品，按照料液比1∶20准确加入70%～95%乙醇溶液，超声功率150 W，超声45 min后，参照“1.3.1”和“1.3.3”分析;②料液比。称取1 g脱脂锁阳样品，按不同料液比（1∶5～1∶30）加入85%乙醇溶液，超声功率150 W，超声时间45 min，后续步骤同①;③超声时间。称取1 g脱脂锁阳样品，料液比1∶20，乙醇浓度85%，超声功率150 W，选取超声波辅助提取的时间为10～60 min，离心取上清液，后续步骤同①;④超声功率。称取1 g脱脂锁阳样品，乙醇体积分数为85%，料液比1∶20，超声时间40 min，超声波功率选择50～300 W，后续步骤同①。

1.3.5  正交试验  在单因素试验基础上，综合考虑多因素相互作用对锁阳熊果酸提取的影响，根据单因素试验结果，采用L9（34）正交设计。

2  结果与讨论

2.1  色谱分析结果

标准品和样品提取液中熊果酸色谱图分别见图1和图2。在该条件下，熊果酸可有效分离。

2.2  单因素试验

单因素试验结果见图3～图6。

由图3可知，乙醇体积分数为85%时，熊果酸含量最大;随着乙醇体积分数增大，含量呈下降趋势。主要原因是乙醇体积分数增大会导致过多的醇溶物质与熊果酸竞争，导致提取的熊果酸含量下降。

由图4可知，随着料液比增大，熊果酸含量逐渐增大，当料液比为1∶20时，熊果酸含量最大;随着料液比增大，熊果酸含量呈下降趋势。主要原因是随着料液比增大，锁阳中其他成分溶解的几率增大，同时延长了后续的浓缩过程，造成熊果酸的损失。

由图5可知，当超声40 min时，熊果酸含量最大。随着超声时间的延长，过多的醇溶物质与熊果酸竞争，影响了熊果酸的提取率，造成含量下降。

由图6可知，超声功率为150 W时，熊果酸含量达到最大;但过强的超声波机械剪切力，破坏了熊果酸的结构，导致熊果酸含量下降。

2.3  正交试验

在单因素试验基础上，设计乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率的4因素3水平正交试验，因素水平见表1，正交试验结果见表2。

由表2极差分析可知，影响熊果酸提取效率的主次因素分别为料液比、乙醇体积分数、超声功率、超声时间。最佳提取工艺为A2B3C1D2，即乙醇体积分数为85%、料液比1∶25、超声时间30 min、超声功率150 W，在此组合下，获得样品中的熊果酸可达1.53%。

2.4 方法评价

吸取标准品10 μL，重复进样6次，求得峰面积RSD为1.39%，表明仪器精密度良好。

吸取标准品10 μL，进样，分别于0～6 h，每间隔0.5 h重复上述操作，求得峰面积RSD为1.9%，结果表明标准品溶液在6 h内基本稳定。

吸取已知浓度的供试品溶液500 μL，加入0.80 mg/mL的熊果酸标准品溶液500 μL，混匀，进样10 μL，平行测定3次，求得熊果酸平均回收率为98.08%。

称取已知浓度的同一样品6份，依次分别制得样品溶液，精密吸取样品溶液10 μL，进样，求得峰面积RSD为1.9%。

3  结论

锁阳中熊果酸在4.0～16.0 μg/μL范围内线性关系良好（r=0.999 8），其回归方程为y=622.7x-85.517，r=0.999 8。精密度RSD为1.39%，加样回收率平均为98.08%，RSD为1.9%。熊果酸提取的最佳工艺条件是：乙醇体积分数为85%、料液比1∶25、超声时间30 min、超声功率150 W，锁阳中熊果酸的含量约为1.53%。该方法提取锁阳中的熊果酸含量较高，可为开发利用相关药材提供参考。

参考文献：

[1] 陈圆华，谢志兵，董静洲.锁阳综合研究概况[J].经济林研究，2005，23（4）：114-117.

[2] 王  勤，孙  芸.HPLC法测定锁阳中没食子酸和原儿茶酸的含量[J].西北药学杂志，2010，25（3）：190-192.

[3] 薛国庆，刘  青，任雪峰，等.火焰原子吸收光谱法测定锁阳中15种金属元素含量[J].光谱学与光谱分析，2004，24（11）：345-347

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