周健，郭瑞霞，王汝兴，赵桂琴

(1.承德医学院中药研究所、河北省中药研究与开发重点实验室，承德 067000；2.石家庄学院化工学院，石家庄 050017)

左旋紫草素转化工艺*

周健1，郭瑞霞2，王汝兴1，赵桂琴1

(1.承德医学院中药研究所、河北省中药研究与开发重点实验室，承德 067000；2.石家庄学院化工学院，石家庄 050017)

目的研究紫草总色素转化为左旋紫草素的最佳工艺条件。方法采用L9(34)正交实验法，以左旋紫草素转化率为指标，优选转化温度、转化时间、2%氢氧化钠的体积与紫草总色素的质量比。结果温度35 ℃，转化时间4 h，2%氢氧化钠的体积与紫草总色素的质量比例为4.5 mL·mg-1时，紫草素转化率最高，平均转化率为64.86%。结论该优选工艺方便简便，经济环保，适合工业化生产。

紫草总色素；左旋紫草素；正交实验

紫草为紫草科紫草属草本植物，分为新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle) Johnst.和内蒙紫草ArnebiaguttataBunge。本品味苦、性寒，长于活血、凉血、解毒，为传统中药材[1]。紫草的有效化学成分主要分为两类：一类是水溶性成分，主要是多糖，含量约2%[2]；另外一类是脂溶性很强的萘醌类紫草总色素[3]，包括左旋紫草素、去氧紫草素、乙酰紫草素、β-羟基异戊酰紫草素等[4]。紫草总色素有抗病原微生物、抗炎、抗过敏、解热、抗肿瘤及止血等药理作用[5]，其中左旋紫草素为主要活性成分[6]。在有关紫草素的制剂中左旋紫草素为主要检测指标，但是目前的研究报道大多局限于紫草总色素的提取分离方法，而忽略了总色素中左旋紫草素的含量，从而影响了紫草总色素药效的发挥。本实验就这一问题进行了系统的研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦1200高效液相色谱仪；HP-8453型紫外-可见分光光度仪；旋转蒸发仪(日本东京理化EYELA)；DZKW-C电子恒温水浴锅(北京光明医疗仪器厂)。

1.2 试药 左旋紫草素，购自中国食品药品检定研究院(批号：110769-200204)；新疆紫草，购自中国药材集团承德药材有限公司，由承德医学院赵桂琴教授鉴定为新疆紫草[Arnebiaeuchroma(Royle) Johnst]的干燥根；甲醇，色谱纯；乙醇，石油醚均为分析纯；氢氧化钠为分析纯。

2 方法与结果

2.1 左旋紫草素提取及碱转化工艺 紫草50 g粉碎至粗粉，加入95%乙醇400 mL，于45 ℃保温浸提15 h，滤过，滤渣加入95%乙醇400 mL，于45 ℃保温浸提8 h，滤过，合并2次滤液，减压回收乙醇，得250 mL浓缩液，由紫外分光光度法测定浓缩液中紫草总色素质量，将适量2%氢氧化钠溶液加入浓缩液，使浓缩液由紫红色变为蓝色，滤过，得滤饼和滤液，滴加适量甲酸于滤液中，使滤液由蓝色变为红色，加入适量石油醚(沸程60～90 ℃)多次萃取至下层不显红色，取上层过滤，得滤液，回收石油醚，于45 ℃干燥，得左旋紫草素粉末状结晶，称重，并用高效液相色谱法测定左旋紫草素含量，计算转化率。

2.2 紫草总色素质量测定 准确吸取提取浓缩液1.00 mL置100.00 mL量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度，用95%乙醇作参比，用紫外分光光度计，选择波长516 nm测定吸光度，按左旋紫草素(吸光系数E为242)计算紫草总色素的质量。

2.3 含量测定方法

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Discovery C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速1.0 mL·min-1；进样量10 μL；检测波长516 nm；流动相：甲醇-水-甲酸(85：15：0.1)；柱温：室温。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取左旋紫草素对照品12.50 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，得1.250 mg·mL-1对照品溶液，作为对照品储备液。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取紫红色粉末状结晶20 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，过0.45 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

2.3.4 标准曲线的制备 精密量取对照品储备液适量，按倍比稀释法制备5个浓度的对照品溶液，浓度分别为1.250，0.625，0.312，0.156，0.078 mg·mL-1，吸取上述溶液，进样10 μL，以进样浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为：Y=10 268X-111.15，r=0.999 49(n=5)，线性范围0.078～1.250 mg·mL-1。

2.3.5 精密度试验 精密取“标准曲线的制备”项下制备的浓度为0.156 mg·mL-1标准溶液，连续进样5次，峰面积RSD为0.43%，表明精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取左旋紫草素对照品溶液(浓度为1.25 mg·mL-1)在室温下放置2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h，分别吸取10 μL，测定峰面积，RSD为0.929%，结果显示在24 h内基本稳定。

2.3.7 重复性实验 取同一样品5份，按”2.3.3”项下方法制备，按上述色谱条件测定，以左旋紫草素含量计算，RSD为0.92%。

2.3.8 回收率实验 取已知含量样品一定量，加入适量对照品，按样品溶液制备方法制备，测定含量并计算回收率，得平均回收率为99.8%，RSD为2.1%(n=6)。

2.4 正交实验 通过单因素试验，选择对紫草总色素转化为左旋紫草素工艺影响较大的3个主要因素，即转化温度(A)、转化时间(B)、2%氢氧化钠体积与紫草总色素的质量比(C)作为考察对象，选取L9(34)正交表进行实验，以提取液中左旋紫草素的转化率为考察指标。因素水平见表1，正交实验安排及结果见表2，方差分析见表3，紫草总色素转化前后HPLC谱见图1。

表1 因素与水平表 Tab.1 Factors and levels

A：转化温度；B：转化时间；C：2%氢氧化钠体积与紫草总素的质量比

A：transformation temperature；B：transformation time；C：ratio of 2% NaoH to alkanna tinctoria pigment

表2 正交试验结果 Tab.2 Design and results of orthogonal test

A：转化温度；B：转化时间；C：2%氢氧化钠体积与紫草总素的质量比

A：transformation temperature；B：transformation time；C：ratio of 2% NaoH to alkanna tinctoria pigment

表3 方差分析表 Tab.3 Analysis of variance

F1-0.05(2，2)=19.00 ；F1-0.01(2，2)=99.00

从转化前后的液相色谱图中可以看出，紫草总色素基本上转化为左旋紫草素，并且含量>84%。正交实验结果表明，因素A、B和C对紫草总色素转化为左旋紫草素都有显著的影响，3个因素对转化率的影响大小依次为C>B>A。因此，紫草素总色素转化为左旋紫草素的最佳工艺条件为：A2B2C3，即转化温度为35 ℃，转化时间为4 h，2%氢氧化钠与紫草总色素用料的比例为4.5 mL·mg-1。

2.5 验证实验 按照转化温度为35 ℃，转化时间为4 h，2%氢氧化钠与紫草总色素用料的比例为4.5 mL·mg-1进行3批小试验证实验，左旋紫草素的转化率分别为63.34%，64.56%，66.68%，平均转化率为64.86%。

A.转化前；B.转化后；1.左旋紫草素

Fig.1 HPLC chromatograms of Arnebia euchroma pigment before and after conversion

3 讨论

在紫草药材中，左旋紫草素具有强大的生物活性，目前在有关紫草素的制剂中也以左旋紫草素为主要检测指标。现阶段，关于紫草天然药物化学成分的研究，大多局限于提取工艺方面，由紫草总色素转化为左旋紫草素的研究报道较少。紫草中所含化学成分主要为紫草总色素，这类物质多数结合成酯的形式存在，通过

碱化可以去掉侧链上的酯基，形成左旋紫草素。再根据结构中具有酚羟基，显酸性，能溶于碱液，加酸酸化又可析出的性质，可得到高纯度的左旋紫草素[7]。

在转化过程中，主要考察了转化温度、转化时间、2%氢氧化钠溶液体积与紫草总色素的质量比。实验过程中发现，过量的氢氧化钠会使溶液的颜色变为绿色，紫草总色素溶液局部过度碱化，总色素的化学结构遭到破坏；而氢氧化钠用量不足又会使溶液显蓝紫色，碱化不完全，降低左旋紫草素的转化率。综合考虑，选择浓度为2%氢氧化钠溶液，转化时间4 h，2%氢氧化钠的体积与紫草总色素的质量比例为4.5 mL·mg-1。实验中，得蓝色油状滤饼，取该滤饼，加石油醚溶解，加入甲酸，生成紫红色溶液，经高效液相检测发现其中左旋紫草素含量达20%，而萘醌类左旋紫草素溶于碱性滤液，原因可能为紫草的醇提溶液中含有非酸性类脂溶性物质，形成类似于水包油体系，使得左旋紫草素包裹其中，造成损失；目前的研究基本都忽略了该滤饼成分，故回收该滤饼，再次应用最佳工艺，最大化利用原料，提高整体的转化率。实验过程中采用醇提石油醚萃取，适用于工业化生产，经济环保，易于回收，对环境污染较小；选用高效液相色谱作为检测方法，指标简单、快速、准确；本研究的完成可促进紫草素提取物在制剂成型工艺方面的应用，有望将其制备成高效、低毒的现代剂型，使紫草素在治疗疾病方面发挥更好的作用。

[1] 王威，邹金华.天然紫草素的研究[J].食品科学，2002，23(6)：56-58.

[2] 乔秀文，兰卫，李洪玲，等.新疆紫草中多糖的超声提取工艺优选[J].中草药，2004，35(8)：57-58.

[3] XIN C，LU Y，JOOST J，et al.Cellular harmacology studies of shikonin derivatives[J].Phytotherrec，2002，6(1)：199-209.

[4] 严松柏，谈献和，胡玉涛.紫草的研究进展[J].时珍国医国药，2003，14(2)：104-106.

[5] 雪梅，王桂玲，费洪荣，等.紫草有效成分的提取及其抗炎作用研究[J].中药药理与临床，2008，24(4)：36-38.

[6] 秦爱萍，张传印，陆丽.左旋紫草素抗炎作用的实验研究[J].现代生物医学进展，2009，9(18)：3432-3434..

[7] 董海荣，紫草素提取转化精制工艺研究[D].天津：天津大学，2004：34-35.

Transforming Process of Shikonin

ZHOU Jian1, GUO Ruixia2, WANG Ruxing1, ZHAO Guiqin1

(1.InstituteofChineseMateriaMedica,ChengdeMedicalCollege,HebeiKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentforTraditionalChineseMedicine,Chengde067000,China； 2.SchoolofChemicalEngineering,ShijiazhuangUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To investigate the optimal condition for transforming alkanna tinctoria pigment into shikonin. Methods Transformation rate of shikonin served as index.Transformation temperature, time, ratio of 2% NaOH to alkanna tinctoria pigment (v/w) was optimized. Results With ratio of 2% NaOH to alkanna tinctoria pigment being 4.5 mL·mg-1, temperature 35 ℃ and the reaction time 4 h, the transformation rate reached the highest, and the average transformation rate was 64.86%. Conclusion This method is easy and simple, and suitable for industrialized production.

Alkanna tinctoria pigment； Shikonin； Orthogonal design

2014-11-05

2015-02-06

*河北省高等学校科学研究计划(Q2012096)；河北省研究生创新资助项目(Z0000004)

周健(1991-)，男，湖南娄底人，在读硕士，主要从事中药新剂型研究。电话：(0)18703349024，E-mail：380795835@QQ.com。

王汝兴(1973-)，男，河北承德人，副教授，在读博士，主要从事中药新剂型研究。电话：(0)13653248958，E-mail：Wangru1973@sina.com。

R286；TQ460.6

B

1004-0781(2015)12-1637-03

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.022