罗小虎 王 韧 王 莉 李永富 沈利杨 王 勇 陈正行

(江南大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，无锡 214122)

高效液相色谱快速测定玉米中黄曲霉毒素的研究

罗小虎 王 韧 王 莉 李永富 沈利杨 王 勇 陈正行

(江南大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，无锡 214122)

黄曲霉毒素(AFT)主要是由真菌产生的具有严重毒性的化学结构类似的次级代谢产物，玉米极易受其污染。通过考察不同激发波长(λEx)和发射波长(λEm)、不同流动相组成，免疫亲和柱(IAC)净化与未经净化的样品对AFT检测结果的影响。结果表明，λEx为360 nm，λEm为440 nm，流动相组成为水-甲醇(65∶35)，玉米中AFT检测分离效果最好；且未经IAC净化的样品，虽有一些杂质干扰检测结果，但方法的线性范围(0.04～26 ng)和检出限(0.1 μg/kg)仍良好，方法加标回收率在81.7%～94.3%，标准偏差在3.6%～6.2%，日内、日间精密度分别为4.5%～5.1%和4.8%～5.5%。该方法具有快速、准确、重现性好、稳定性高、成本低的优点，适合大批次污染AFT的玉米检测。

高效液相色谱 黄曲霉毒素 玉米 免疫亲和柱 检测

黄曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类具有严重毒性的次级代谢产物[1]。在已知的二十余种AFT中，最常见且毒性最强的有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)。由于热带和亚热带地区的温度和湿度适宜各类产AFT的真菌生长，因此，上述地区的玉米、花生、小麦和其他农产品极易受AFT污染[2-4]。据联合国粮农组织(FAO)估计，世界粮食作物每年被真菌毒素污染达25%，造成了极大的经济损失，这其中又以AFT危害最大[5]。

玉米是我国重要的食品原料之一，在一些地区，由于收获、加工和储藏不当，玉米相对其他原料，如花生、小麦和稻米等，更易被AFT污染[3, 6]。虽然不断改进玉米干燥、储藏和加工等措施，但目前大多数的加工条件下AFT仍很难被破坏[7-9]。由于AFT污染严重，且AFT污染后很难去除，因此，为了避免AFT污染超标的玉米被人和动物食用，良好的AFT检测方法就变得至关重要。目前，AFT的检测方法主要有薄层色谱(TLC)法[10]、酶联免疫(ELISA)法[11-12]、液相色谱(HPLC)法[13-15]和液相色谱-质谱联用(LC-MS)法[16-17]。上述方法中，HPLC法是目前应用最广的检测AFT方法，该方法具有准确度高、重现性好等优点，但也存在样品前处理复杂、操作繁琐、检测成本较高、不利于大批次样品检测等缺点，因此，该方法仍有待进一步改进。

由于玉米样品基质复杂，样品中杂质易干扰AFT的检测，因此，通常样品在检测前，需经免疫亲和柱(IAC)[18]或固相萃取柱(SPE)[19]净化，这样造成检测步骤增加、分析速度减慢、费时费力、且净化柱成本较高，最终导致检测成本增加。本研究通过考察不同激发波长(λEx)和发射波长(λEm)、不同流动相的组成对AFT的分离和检测效果，比较玉米样品经IAC净化与未经净化的样品分离和检测效果，以建立一种分析速度快、分离检测效果好、准确度高、成本低的AFT定量分析方法，满足大批次检测AFT的需求。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

AFT污染与未污染的玉米：湖南岳阳市售；甲醇、乙腈(色谱纯)：美国Fisher公司；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混标(纯度≥99%)：美国Supelco公司；AflaClean IAC：德国Lctech公司。

1.1.2 仪器与设备

1260系列Agilent高效液相色谱仪(带荧光检测器)、ZOBRAX SB C18色谱柱：美国Agilent科技有限公司；DCY-12G型氮吹仪：青岛海科仪器股份有限公司；Simplicity UV型超纯水仪：美国Millipore公司；BSA124S-CW分析天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；SHZ-B型水浴恒温振荡器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 AFT标准溶液的配制

将AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混标液(浓度分别为1.007、0.286、1.071、0.330 μg/mL)60 ℃氮气吹干，甲醇重新溶解并定容，储备液-20 ℃储藏。临用前，取适量AFT标准储备液，60 ℃氮气吹干，流动相逐步稀释配成以AFB1浓度为0.01、0.025、0.05、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5 μg/mL的AFT标准工作液。

1.2.2 AFT检测λEx和λEm的选择

适当浓度的AFT混标经高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)检测，选择不同的λEx(360、365 nm)和λEm(440、450、460 nm)，考察不同λEx和λEm下AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的峰面积，选择检测AFT具有最大灵敏度的λEx和λEm。

1.2.3 样品提取与净化

玉米粉碎，过0.85 mm孔径筛，取20 g玉米粉入150 mL锥形瓶，加50 mL甲醇-水(80∶20)，150 r/min震荡45 min，抽滤；方法1)：取4 mL滤液入10 mL离心管；方法2)：取7 mL滤液入50 mL离心管，加43 mL PBS缓冲溶液(pH 7.2)，稀释液入IAC，10 mL蒸馏水冲洗IAC，再用1 mL甲醇洗脱IAC 2次，每次5 min。方法1)与方法2)中样品溶液均在60 ℃下氮气吹至近干，200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸溶解剩余残渣，立即盖紧小瓶并涡旋混合15 s，40 ℃衍生化30 min后，60 ℃下氮气吹至近干，1 mL水-乙腈(85∶15)重新溶解残渣，涡旋混合15 s，过0.22 μm有机滤膜，滤液收集至1 mL进样瓶中，4 ℃下保存直至HPLC分析。

1.2.4 玉米样品中AFT的HPLC检测方法

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱温：35 ℃；λEx=360 nm，λEm=440 nm；流动相∶水-甲醇(65∶35)；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。

2 结果与讨论

2.1 λEx和λEm对AFT检测结果的影响

HPLC-FLD检测AFT时，不同的λEx和λEm，会造成AFT的检测灵敏度不同；另外，不同样品，由于基质差异，λEx和λEm也会对检测结果造成影响。本研究分别选择了不同λEx(360、365 nm)和不同λEm(440、450、460 nm)，分析不同波长下AFT的峰面积，确定最佳λEx和λEm。

由图1看出，当λEx=360 nm，λEm=440 nm时，AFB1峰面积最大，灵敏度最高。λEx=365 nm，λEm=440 nm时，AFB1峰面积较λEx=360 nm和λEm=440 nm时低，且AFB2、AFG1、AFG2峰面积与λEx=360 nm和λEm=440 nm时峰面积接近；比较其他λEx和λEm，虽然有些λEx和λEm下，AFB2、AFG1、AFG2较大峰面积，但AFB1峰面积都较小，考虑到AFB1在玉米中污染最严重，且AFB1毒性最强，因此，首先选择AFB1检测灵敏度最好的条件，故选择λEx=360 nm，λEm=440 nm作为检测AFT的λEx和λEm。

图1 不同λEx和λEm对AFT检测结果的影响

2.2 流动相对AFT检测结果的影响

流动相是影响样品中待测目标物与杂质分离的重要因素，本研究通过对已有研究文献的总结，选取了7组能有效将目标物与杂质分离开来的流动相，然后分析不同流动相条件下AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的峰面积，使选择的流动相在将待测目标物与杂质良好分离的同时，待测目标物具有较高的检测灵敏度，另外，本研究也从节约试剂、减少仪器运作时间的角度考虑，选择出更适合的流动相。

从图2可以看出，流动相组成为65∶35∶0(水-甲醇-乙腈)时，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的峰面积都要高于或等于其他流动相条件下的峰面积；另外，经单因素方差分析(ANOVA)，流动相组成为65∶35∶0(水-甲醇-乙腈)时，AFT总的峰面积显著高于其他流动相条件下的峰面积(P<0.05)。同时，AFT污染的玉米样品的HPLC色谱图表明(图3)，该流动相组成能将待测目标物与杂质良好分离，且该流动相具有检测时间短、所需流动相成本低、溶剂毒性小等优点。因此，选取的流动相为水-甲醇(65∶35)。

图2 流动相对AFT检测结果的影响

2.3 净化方式对AFT检测结果的影响

已有研究文献表明，AFT污染的玉米样品经IAC净化后，能将大多数干扰杂质进行洗脱分离，但使用IAC也存在操作繁琐，分析速度慢，检测成本高，洗脱分离干扰杂质的同时，容易造成目标物流失等缺点[18, 20]。因此，研究比较了AFT污染的玉米经IAC净化与未经净化的检测结果，结果显示在图3中。

图3c中显示，与未经净化的样品(图3b)相比，经IAC净化的样品(图3c)很少有杂质干扰AFT的检测，然而，经过净化的样品，未检测到AFG1，这可能是由于IAC净化过程中，AFG1与杂质一起被洗脱；未经净化的样品(图3b)，虽有杂峰，且对检测结果有一些干扰，但从表2和表3中的加标回收率及精密度试验结果看，未过净化柱的样品加标回收率在81.7%～94.3%之间，日内、日间精密度试验中相对标准偏差(RSD)小于6.0%，因此，该提取检测AFT的方法对实际样品的测定影响很小。因此，本研究方法的样品提取溶液不经IAC净化，直接HPLC-FLD测定样品中的AFT含量。另外，从图3b看出，该批玉米样品中，未检出AFG2。

注：a)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混标;b)未经IAC净化的AFT污染的玉米样品；c)IAC净化AFT污染的玉米样品。

图3 色谱图

2.4 方法的线性范围与检出限

根据1.2.4中色谱条件，分别测定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的混标溶液，以HPLC-FLD测得的峰面积(mAU)为纵坐标(Y)，以进样质量(ng)为横坐标(X)绘制标准曲线，根据3倍信噪比(S/N)的峰响应值，得出此方法的检出限，结果如表1所示。

表1 AFT的线性范围与检出限

2.5 样品加标回收率试验和精密度

对未污染AFT的玉米进行不同水平的加标回收试验，对加标量为10、20、40 μg/kg的样品分别做3个平行，根据1.2.3中样品未经净化方法制备样品，按1.2.4条件检测玉米中AFT含量，最后得到方法回收率，结果见表2；对加标量为20 μg/kg的样品每天提取检测3次，重复提取检测3 d，方法精密度结果见表3。表2显示，该方法在不同加标量下，加标回收率在81.7%～94.3%，标准偏差(SD)在3.6%～6.2%。表3显示，方法日内精密度在4.5%～5.1%，日间精密度在4.8%～5.5%。方法具有良好的回收率和日内、日间精密度。

表2 样品加标回收率试验结果

表3 精密度试验结果

3 结论

本研究考察了λEx和λEm，流动相组成对AFT检测结果的影响，结果当λEx和λEm分别为360 nm和440 nm，流动相组成为水-甲醇(65∶35)时，AFT及污染AFT的玉米样品经HPLC-FLD分离检测效果最好。该方法在测定AFT时，具有良好的线性范围及检出限，经日内、日间精密度及方法回收率考察，重现性和稳定性良好。该方法操作简便、快速准确，适合检测大批量污染AFT的玉米样品。

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Rapid Detection of Aflatoxins in Corns by High Performance Liquid Chromatography

Luo Xiaohu Wang Ren Wang Li Li Yongfu Shen Liyang Wang Yong Chen Zhengxing
(School of Food Science and Technology State Key Laboratory of Food Science and Technology National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122)

Aflatoxin (AFT), as seriously toxic and similarly structured secondary metabolites of fungi, has been proved to be prone to contaminating corns. The effects of excitation (λEx) and emission (λEm) wavelengths, mobile phase composition and immunoaffinity column(IAC) purification on AFT detection have been studied. AFT was separated and detected optimally at λEx=360 nm and λEm=440 nm with a mixture of water and methanol (65∶35) as mobile phase. Although the sample,unpurified by IAC,retained some interfering impurities, the method was still of desirable linear range (0.04～26 ng) and detection limit (0.1 μg/kg). The spike recovery, standard deviation, and within-and intra-day precisions of the method are 81.7%～94.3%, 3.6%～6.2%, 4.5%～5.1% and 4.8%～5.5% respectively. The method is suitable for the detection of mass AFT-contaminated corns with the advantages of being rapid, accurate, highly reproducible,stable and low cost.

HPLC, aflatoxins, corn, immunoaffinity column, determination

TS207

A

1003-0174(2014)06-0099-05

国家自然科学基金(31371874, 31171780035, 3110 1383, 31201381)，公益性行业科研专项(201203037, 201313005, 200903043-02)，国家科技支撑计划(2012BAD34 B02)

2013-07-04

罗小虎，男，1983年出生，博士，粮食安全

陈正行，男，1960年出生，教授，博士生导师，粮食精深加工