刘晓燕 吴亚坤 王建英 杜志强

（内蒙古科技大学 数理与生物工程学院，内蒙古 包头 014010）

布鲁菌是造成布病的直接病原，它可以在人畜之间传播，造成人畜共患疾病[1]。目前，对于布病防治的策略，亚单位疫苗成为了一个新的热点。本文以猪型布鲁菌的omp31 基因（全ORF 序列）作为研究对象，进行了蛋白质的诱导表达、蛋白纯化、抗体制备与抗体质量检测等研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

含有pGEX-4T-1-omp31 重组质粒的大肠杆菌BL21 表达菌株：试验前期构建的表达菌株，在实验室低温冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 重组蛋白的诱导表达

将试验前期构建的含有pGEX-4T-1-omp31 重组质粒表达菌株进行过夜活化，之后转接于新鲜LB 培养基进行转培养4 h，加入IPTG进行诱导表达，结果利用SDS-PAGE 检测[2]。

1.2.2 亲和纯化

收集诱导后的表达菌株菌体，利用超声波进行破碎，高速离心之后，将上清液利用GST 柱进行亲和纯化[3]。

1.2.3 抗体制备将纯化得到的重组蛋白作为抗原，与佐剂混合之后注射家兔，制备多克隆抗体，共需注射5 次，每次间隔10 天[4]。

1.2.4 抗体质量检测

抗体制备结束之后，收集家兔血清，利用western blot 方法检测抗体质量[5]。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白诱导表达与纯化结果

将重组表达菌株进行诱导表达，离心收集菌体超声波破碎之后，收集上清液进行亲和纯化。SDS-PAGE 检测结果显示：重组蛋白正确表达，纯化获得介于43-66.2 kD 之间的重组蛋白质，与预期的55.3 kD 一致。

图1 布鲁菌重组Omp31 的诱导表达与纯化结果

2.2 Western blot 结果

以纯化获得的重组Omp31 蛋白作为抗原，与弗氏佐剂混匀之后，注射家兔制备多克隆抗体，收集血清之后进行western blot 检测。结果显示：制备的多克隆抗体可以较好的识别抗原蛋白质，说明重组Omp31 蛋白作为抗原的免疫原性良好。

图2 western blot 检测抗体质量的结果

3 讨论

目前，从基因入手研制蛋白类亚单位疫苗成为了一个新的科研热点，针对布病的活菌疫苗存在反毒的现象，更加促进了蛋白质抗原疫苗的研究深度。本论文以猪型布鲁菌的omp31 基因作为研究对象，对该基因的表达序列全长进行了重组表达与抗体制备的研究，通过亲和纯化获得了与预期分子量相一致的重组蛋白质，利用其制备的多克隆抗体可以清晰的识别抗原分子，说明重组Omp31 蛋白质具有较好的免疫原性，可以作为亚单位疫苗的候选分子进行深入研究。

［1］史新涛，古少鹏，郑明学，等.布鲁氏菌病的流行及防控研究概况[J].中国畜牧兽医，2010，37(3)：204-207.

［2］Ren Q，Zhou J，Jia YP，et al.Cloning and characterization of Rap GTPase from the Chinese white shrimp Fenneropenaeus chinensis [J].Dev Comp Immunol，2012，36(1)：247-252.

［3］Du ZQ，Ren Q，Zhao XF，et al.A double WAP domain (DWD)-containing protein with proteinase inhibitory activity in Chinese white shrimp，Fenneropenaeus chinensis[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2009，154(2)：203-210.

［4］Du ZQ，Li XC，Wang ZH，et al.A single WAP domain (SWD)-containing protein with antipathogenic relevance in red swamp crayfish，Procambarus clarkia[J].Fish Shellfish Immunol，2010，28(1)：134-142.

［5］Li XC，Du ZQ，Lan JF，et al.A novel pathogen -binding gC1qR homolog，FcgC1qR，in the Chinese white shrimp，Fenneropenaeus chinensis [J].Dev Comp Immunol，2012，36(1)：400-407.