尤玲玲，陈永慧，刘金福，靳晓明，冯 超

(1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384;

2.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384)

糖尿病是一种全球范围内严重危害人类健康的常见内分泌代谢疾病，有95%的糖尿病患者为Ⅱ型糖尿病［1］。Ⅱ型糖尿病是一种复杂的多基因疾病，胰岛β细胞功能缺陷和胰岛素抵抗是其发病的两个主要原因［2］。体内胰岛素对肝脏、脂肪和肌肉三大主要靶组织都有影响［3］。胰岛素抵抗是Ⅱ型糖尿病、肥胖症、高血压、血脂异常和心血管疾病的多元综合症［4］。胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指正常剂量的胰岛素产生低于其生物学效应的一种病理学状态，表现为胰岛素促进外周组织摄取和利用葡萄糖以及抑制肝糖输出的效应减弱［5］。肝脏及外周组织是胰岛素作用的靶组织，是胰岛素抵抗产生的主要部位。

建立胰岛素抵抗的细胞模型，不仅可广泛用于细胞水平探讨胰岛素抵抗形成的机制和葡萄糖代谢障碍的病理、生理学环节，而且便于筛选具有改善胰岛素抵抗活性的成分。HepG2细胞来源于肝细胞，系一种表型与肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株［6］，在高剂量的胰岛素条件下，HepG2细胞表面胰岛素受体的数目下降，下降程度与胰岛素水平及刺激持续的时间呈正相关［7］，因此HepG2是体外研究胰岛素抵抗发病机制和降糖活性物质筛选的理想细胞模型。

苦瓜别名凉瓜、锦荔枝、癞瓜，具有清热解毒、滋养强壮、明目和解劳乏之功效［8］。近年来，对苦瓜成分的研究报道很多且较深入，从苦瓜的果实、根、茎、叶、花及种子等部位中分离出苦瓜皂苷、多糖、蛋白质和多肽等多种化学成分，并证明其具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病、提高免疫力等多种功效［9］。本文以人肝癌HepG2细胞为研究载体，建立最佳胰岛素抵抗模型，探究苦瓜皂苷对胰岛素抵抗的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

HepG2细胞株 北京肿瘤医院细胞库;牛胰岛素、DMSO Sbasebio公司;DMEM高糖培养基Hyclone公司;胎牛血清 天津灏洋生物技术有限公司;青-链霉素美国Gibco公司;胰蛋白酶(1∶250) 天津博美科生物技术有限公司;葡萄糖测定试剂盒 北京普利莱基因技术有限公司;苦瓜皂苷 我校食品营养与免疫学实验室提供，纯度:58%;其余化学试剂均为国产分析纯。

TD5A-WS型台式低速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;IX51倒置相差荧光显微镜 日本Olympus公司;超净工作台 苏州净化设备有限公司;3111型CO2细胞培养箱 美国Thermo Forma公司;Bio-Tek ELX800型全自动酶标仪 美国宝特公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HepG2细胞的常规培养 HepG2细胞用含15%胎牛血清，1‰青-链霉素的DMEM培养液，于37℃，5%CO2饱和湿度环境下培养。

1.2.2 胰岛素抵抗HepG2细胞模型(HepG2/IR)的建立

1.2.2.1 胰岛素添加浓度的确定 将HepG2细胞制成单细胞悬液，以105个/mL细胞密度接种于96孔板，每孔 100μL，于 37℃，5%CO2条件下培养细胞12h，加入新鲜配制的胰岛素(终浓度为 0.5、5、10、15、30、60、150、300μg/mL)继续培养细胞24h，每组 6个复孔，同时设立正常培养的细胞作为对照，用葡萄糖氧化酶法测定细胞培养液中葡萄糖的含量，计算对照组与不同胰岛素浓度组细胞的葡萄糖消耗量，选择葡萄糖消耗量最大，即胰岛素敏感性最强时胰岛素的浓度为最佳添加浓度。

1.2.2.2 确定胰岛素作用细胞的最佳时间 确定了最佳胰岛素浓度后，设对照组和作用时间组(12、24、36、48h)，依1.2.2.1方法向孔板中加入最佳浓度胰岛素溶液，分别作用细胞 12、24、36、48h，计算正常组与各作用时间组的细胞葡萄糖消耗量差值，选择葡萄糖消耗量差值最大的作用时间为胰岛素作用最佳时间。

依照上述方法分别得出胰岛素作用最佳浓度和作用时间，由此建立适宜的高浓度胰岛素诱导的HepG2/IR细胞模型。

1.2.3 苦瓜皂苷干预HepG2/IR细胞

1.2.3.1 苦瓜皂苷对HepG2/IR葡萄糖消耗量的影响 以细胞密度为2×105个/mL接种于96孔板，每孔100μL，培养12h，分别设立HepG2细胞阴性对照组，HepG2/IR模型组、盐酸吡格列酮阳性对照组(4μg/mL)、苦瓜皂苷干预组(终浓度为 10、100、200、300、500、1000、2000μg/mL)。阴性对照组和 HepG2/IR模型组中加入50μL DMEM培养液，HepG2/IR模型组、阳性对照组以及苦瓜皂苷干预组每孔加入50μL胰岛素溶液至终浓度30μg/mL，孵育36h后，阳性对照组中加入50μL盐酸吡格列酮溶液(终浓度为4μg/mL)，苦瓜皂苷干预组分别加入50μL终浓度为 10、100、200、300、500、1000、2000μg/mL 的苦瓜皂苷溶液，孵育12h，3600r/min离心10min，按葡萄糖试剂盒测定方法测定细胞培养液中葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗量。

葡萄糖含量(mmol/L)=标准品浓度×［(OD样品管-OD空白管)/(OD标准管-OD空白管)］

1.2.3.2 MTT测定HepG2/IR细胞活性 弃去96孔板中苦瓜皂苷干预后的培养液，每孔加入MTT(终浓度5mg/mL)溶液20μL，继续培养4h后，弃去培养板中溶液，每孔加入100μL DMSO终止反应，充分振摇，利用酶标仪检测波长490nm下吸光度值［10］。

1.3 数据统计分析

实验数据用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，数据以±s表示，采用单因素差异性分析以及多重比较组间差异。

2 结果与分析

2.1 胰岛素浓度和作用时间对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响

2.1.1 不同浓度的胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响 分别设立对照组和胰岛素剂量组(0.5、5、15、30、60、150、300μg/mL)作用 HepG2 细胞 12h 后测得细胞葡萄糖消耗情况见表1。当胰岛素浓度由15μg/mL增加到300μg/mL时，与正常组相比，葡萄糖含量均有显著降低，结合考虑葡萄糖消耗率，发现当胰岛素浓度达30μg/mL时，葡萄糖消耗率最高达18.28%。说明30μg/mL的胰岛素诱导HepG2细胞胰岛素抵抗程度达到最大。

表1 不同浓度的胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗情况的影响Table 1 Effect of different concentration insulin to the glucose consumption of HepG2

2.1.2 胰岛素作用不同时间对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响 设立不同作用时间组(12、24、36、48h)的同时，设立相应的各时间点的阴性对照组，孵育好的细胞加入胰岛素至终浓度30μg/mL，分别作用12、24、36、48h，测得细胞葡萄糖消耗情况见表2。随着胰岛素作用时间的延长，不同作用时间组细胞葡萄糖的消耗均低于正常组，分别降低14.07%，17.76%，20.28%，18.07%。当胰岛素作用细胞36h时与其相应的阴性组比较，葡萄糖消耗差异最大达20.28%，差异极显著(Ap＜0.01);48h时葡萄糖消耗量差值也较大，且差异极显著(Ap＜0.01)，但考虑到胰岛素作用HepG2细胞的时间过长，中间又没有换液，其细胞活力可能会有所下降。因此，本实验胰岛素诱导细胞HepG2建立胰岛素抵抗模型的最佳作用时间为36h，最佳胰岛素浓度为30μg/mL，同时也印证了HepG2细胞株是国内外应用较广泛的研究胰岛素抵抗机制的细胞模型［11］。

表2 胰岛素不同作用时间对HepG2细胞葡萄糖消耗情况的影响Table 2 Effect of different insulin effect time to the glucose consumption of HepG2 cells

2.2 苦瓜皂苷对HepG2/IR细胞葡萄糖消耗量及细胞活性的影响

2.2.1 不同浓度的苦瓜皂苷对HepG2/IR细胞葡萄糖消耗量的影响 成功建立HepG2/IR细胞模型后，设立不同浓度的苦瓜皂苷作用HepG2/IR细胞，测定葡萄糖消耗情况见表3。与HepG2/IR模型对照组相比较，随着苦瓜皂苷浓度的增大，葡萄糖含量均有所回升，说明苦瓜皂苷可以在一定程度上缓解胰岛素抵抗，其中300、500μg/mL剂量的苦瓜皂苷作用显著(bp＜0.05，)。与盐酸吡格列酮阳性对照组相比较，300、500μg/mL剂量的苦瓜皂苷作用显著(cp＜0.05)。同时结合考虑葡萄糖消耗率，300μg/mL剂量的苦瓜皂苷作用效果最理想。

表3 不同浓度的苦瓜皂苷对HepG2/IR细胞葡萄糖消耗情况的影响Table 3 Effect of different concentration bitter melon saponin to The glucose consumption of HepG2/IR

当苦瓜皂苷浓度高于300μg/mL时，葡萄糖消耗量整体呈现下降趋势，尽管葡萄糖消耗量随着浓度的增加而减少，但与HepG2/IR模型组相比较，葡萄糖消耗量仍有所提高，说明苦瓜皂苷还是在不同程度上促进了HepG2/IR细胞消耗葡萄糖。

2.2.2 苦瓜皂苷对HepG2/IR细胞活性的影响 如图1所示，与阴性对照组相比，HepG2/IR模型组，盐酸吡格列酮阳性对照组以及苦瓜皂苷组的细胞活性均低于阴性对照组，这是因为高浓度的胰岛素降低了HepG2细胞的活性;苦瓜皂苷组与阴性对照组相比较，苦瓜皂苷浓度由10μg/mL增加至300μg/mL时，随着皂苷浓度的增加，细胞的活性逐渐提高，达到300μg/mL时，细胞活性显著提高，吸光度值达0.226，差异具有统计学意义(p＜0.05);高于300μg/mL时，HepG2/IR细胞的活性反而降低了，可能是过高剂量的苦瓜皂苷存在毒性效应，这一点与葡萄糖消耗量实验结果一致。

图1 不同浓度的苦瓜皂苷对HepG2/IR细胞活性的影响Fig 1. The effect of different concentration bitter melon saponin to activity of HepG2/IR

3 结论

本文以HepG2细胞为研究对象，采用一系列不同浓度的胰岛素作用HepG2细胞，发现30μg/mL胰岛素作用细胞36h时产生的胰岛素抵抗效果最强。苦瓜皂苷浓度在低于300μg/mL时，随着浓度的增大，可改善由高浓度胰岛素带来的细胞活性降低。当苦瓜皂苷浓度高于300μg/mL时，随着浓度的增大对HepG2细胞产生的剂量毒性效应增加，抑制了细胞的生长。可见，在一定的浓度范围内，300μg/mL苦瓜皂苷可以显著改善HepG2/IR细胞的活性，同时提升葡萄糖消耗量，起到较好的降糖效果。

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