杨静慧等

摘 要： 为了解愈伤组织形成单细胞克隆体系的关键因素，以青睐苜蓿为试材，比较了两种形态的愈伤组织的生理生化指标和形态结构变化。结果表明，两种类型的愈伤组织细胞膜透性和丙二醛含量无明显差异；细胞内可溶性糖含量和过氧化物酶POD活性差异较大，其中可溶性糖含量为：松散型>巨大型，松散型是巨大型的2.09倍；POD酶活性：巨大型>松散型，巨大型是松散型的1.35倍；巨大型愈伤组织细胞较大、组织排列疏松、细胞高度液泡化、细胞质较稀薄，而松散型愈伤组织细胞较小、组织排列松散、细胞液泡较小、细胞质较浓。巨大型与松软型愈伤组织细胞的膜代谢程度相同，但松散型愈伤组织细胞中糖积累多，细胞代谢旺盛；而巨大型愈伤组织糖积累少，细胞衰老。

关键词：愈伤组织； 形态结构；生理生化；酶；膜代谢

中图分类号：S551.7 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.08.005

Abstract： In order to learn the key factors of callus development on single cell clone， characteristics of physiology and biochemistry and morphological structure of two types of alfalfa callus was studied. The results showed that the cell membrane permeability and malondialdehyde content was same for the two types of callus； but their soluble sugar content and peroxidase activity in cells was very different， for the soluble sugar content： soft callus > huge callus， and soft callus was 2.09 times of huge callus； for peroxidase activity： huge callus > soft callus， and huge callus was 1.35 times of soft callus. Huge callus cells were larger， loosely arranged， cell vacuolization and cytoplasm was thiner than soft callus. However， soft callus cells were smaller， loosely arranged， cell vacuoles was smaller and cytoplasm was thicker than hug callus. Huge cells had the same membrane metabolic with soft cells， but soft cells had higher sugar accumulation than huge cells， and soft cells metabolism were vigorous， while huge cells were more aging.

Key words： callus； morphological structure； physiological and biochemical； enzyme； membrane metabolic

近年来，对于胚性愈伤组织的诱导和体细胞胚的发生研究取得了较大的进展[1-3]。但是，由许多胚性愈伤组织诱导培养的体细胞细胞系由于其起源的杂合性，往往缺少稳定性[4-5]。而诱导外植体分裂形成形态结构一致的愈伤组织，即利用均质的、松散的愈伤组织可以建立单细胞克隆纯系，就具有更好的稳定性和非嵌合性[6]。目前，培养这种均质的、松散的愈伤组织体系的研究较少[7]。这种单细胞克隆体系与愈伤组织的生理代谢有密切关系[8]。李茜[6]的研究认为，与愈伤组织的可溶性蛋白质、可溶性糖和淀粉含量及抗氧化物酶（POD，SOD ，CAT） 活性有关。陈超等[9]认为，与SOD、CAT、总谷胱甘肽氧化物酶的活力、超氧化物和丙二醛含量有关。笔者研究了两种形态的愈伤组织的细胞膜透性、丙二醛含量、细胞内可溶性糖含量和过氧化物酶POD活性等生理生化变化，比较了他们的形态差异，研究了具有胚性愈伤组织特点的、均质愈伤组织的特性，为单克隆细胞系的建立提供了依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

青睐苜蓿种子来自于中国农科院，选取色泽良好饱满的种子播种于天津农学院温室，播种基质为蛭石，获取实生苗。

在超净台中剪取青睐苜蓿实生苗的叶片，将叶片边缘剪掉，并剪成0.5 cm2的小块作为外植体，备用。将剪好的外植体消毒，分别接种到1/2 MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 150 mg·L-1 Vc + 15 g·L-1蔗糖培养基上，诱导巨大型愈伤组织；接种到MS + 0.25 mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1KT+150 mg·L-1Vc+30 g·L-1蔗糖培养基上，进行松散型愈伤组织的诱导（详细见专利201310118903.5）。培养条件为：温度20～24 ℃，光照强度500～1 000 lx，24 h光照。

获得的愈伤组织分别进行细胞膜透性（电导率法）、可溶性糖（蒽酮法）、丙二醛含量（硫代巴比妥酸比色法和用Lambda 35紫外分光光度计测定）和POD酶活性（采用愈创木酚比色法和Lambda 35紫外分光光度计测定）测定。

2 结果与分析

2.1 苜蓿两种愈伤组织细胞膜透性的比较

由图1可知，苜蓿愈伤组织中巨大型细胞愈伤组织的膜透性为54.30%，松散型细胞的愈伤组织膜透性为54.74%个百分点，仅比巨大型的愈伤组织的细胞膜透性高出0.44个百分点。

2.2 苜蓿两种类型愈伤组织丙二醛含量的比较

由图2可知，苜蓿巨大型愈伤组织的丙二醛含量为0.001 406 mol·g-1，松散型的愈伤组织的丙二醛含量为0.001 506 mol·g-1，松散型丙二醛含量比巨大型的丙二醛含量仅仅高出0.000 1 mol·g-1，基本无差异。

2.3 苜蓿两种类型愈伤组织可溶性糖含量的比较

由图3可知，巨大型细胞愈伤组织的可溶性糖含量是0.56%，松散型愈伤组织的可溶性糖含量为1.17%，松散型愈伤组织比巨大型高0.61个百分点，是巨大型的2.09倍，两者有较大的差异。这一结果与霍合强[10]的报道一致。

比较两种愈伤组织的形态解剖结构（图1、2）可以看出，巨大型愈伤组织的细胞中含有中央大液泡，液泡化程度远远高于松散型愈伤组织，细胞质浓度相对来说较低。而松散型愈伤组织细胞中仅有一些小液泡，细胞质浓，在细胞中占的比例大。这可能是巨大型愈伤组织细胞中可溶性糖含量低的原因之一。

2.4 苜蓿两种类型愈伤组织中POD酶活性比较

由图4可知，巨大型愈伤组织细胞的POD酶活性是6 623.7 U·g-1·min-1，松散型愈伤组织细胞的POD酶活性是4 888.7 U·g-1·min-1，巨大型愈伤组织细胞POD酶活性是松散型的1.35倍，差异较大。

过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。过氧化物酶常作为组织老化的一种生理指标[11]。

所以，巨大型愈伤组织细胞的POD酶活性高，表明其组织较松散型愈伤组织老化或衰老程度高。图1、2的愈伤组织形态结构也表明，巨大型愈伤组织的细胞液泡化程度和细胞的分化程度均较松散型的高，细胞也较大，细胞质稀薄、细胞质浓度较低，叶绿体等细胞器也较少，代谢活跃程度较低。

总之，巨大型和松散型这两种类型的愈伤组织在细胞膜透性和丙二醛含量上没有显著差异，但在可溶性糖含量和POD酶活性两项指标上差异比较大，其中松散型愈伤组织的可溶性糖积累高于巨大型，POD酶活性低于巨大型愈伤组织，即巨大型愈伤组织碳水化合物的积累较少，细胞的衰老程度较高。因此，松散型愈伤组织是代谢更加旺盛的愈伤组织。

3 结论与讨论

巨大型和松散型这两种类型的愈伤组织的细胞膜透性差异不大（54%～55%），与两者均为薄壁细胞，且膜代谢反应基本相同有关。

比较两种愈伤组织的形态结构（图1、2）可以看出，松散型愈伤组织细胞呈浅白或白色，半透明，细胞壁薄；巨大型愈伤组织细胞呈浅黄色，细胞较大，细胞壁薄。此外，两种愈伤组织的膜脂过氧化产物丙二醛含量也无差异。说明两者的生物膜完好程度或生物膜受外界影响的程度也相同。因为丙二醛是膜脂过氧化的终产物之一，其含量高低可以作为考察细胞受到胁迫严重程度的指标之一，它的主要伤害是导致膜脂过氧化[12]，损伤生物膜结构，主要是细胞质膜，使得细胞膜结构和功能受到损伤，改变膜的通透性，从而影响一系列生理生化反应的正常进行。因此，两种愈伤组织的细胞膜透性和丙二醛含量均相同，较一致地说明了两种愈伤组织膜代谢程度相同，未受到外界的伤害。

参考文献：

[1] 江荣翠，彭方仁，谭鹏鹏.滇楸体胚发生及生理生化特性研究[J].林业科技开发，2014，28（1）：25-29.

[2] 张建伟，王军辉，马建伟.粗枝云杉胚性愈伤组织增殖后期的体细胞胚发生方式转变[J].植物生理学报， 2014，50（2）：197-202.

[3] 张云超，杨细燕，何良荣，等.鲁棉6号体细胞胚胎发生过程及植株再生[J].华中农业大学学报，2014，3（2）：22-27.

[4] 靳小翠，李志辉，杨模华，等.马尾松幼胚胚性愈伤组织诱导的研究[J].中南林业科技大学学报， 2010（4）：80-84.

[5] 冀爱青，彭功波.核桃子叶胚性愈伤组织的诱导[J].河南农业科学，2010（7）：86-88.

[6] 李茜，张存旭，秦萍.白皮松胚性和非胚性愈伤组织生理生化特性研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2008，36（8）：151-160.

[7] 苗博瑛，刘艳军，杨静慧.黑莓松散型胚性愈伤组织的诱导[J].山西农业科学，2014，42（3）：209-212，216.

[8] 李家儒，唐晓红，黄鲲，等.红豆杉单细胞克隆的建立[J].生物技术，1996，6（3）：8-10.

[9] 陈超，王桂兰，陈玉斌.红掌不同类型愈伤组织及再生团块生理指标的测定[C]//中国植物生理学会第十次会员代表大会暨全国学术年会论文摘要汇编.开封：中国植物生理与分子生物学学会，河南大学， 2009.

[10] 霍合强，邓秀新.柑桔胚性愈伤组织的诱导、保存和利用[J].植物生理学通讯，2000，36（2）：181-186.

[11] 秦婷婷.油菜子叶衰老时相关酶类、类囊体膜组分与光谱特性的研究[D].成都：四川大学，2006.

[12] 王梅，丁祥，何素兰，等.甘薯不同品种叶片中抗氧化相关活性成分的动态变化研究[J].西华师范大学学报：自然科学版，2012，33（4）：330-337.

2 结果与分析

2.1 苜蓿两种愈伤组织细胞膜透性的比较

由图1可知，苜蓿愈伤组织中巨大型细胞愈伤组织的膜透性为54.30%，松散型细胞的愈伤组织膜透性为54.74%个百分点，仅比巨大型的愈伤组织的细胞膜透性高出0.44个百分点。

2.2 苜蓿两种类型愈伤组织丙二醛含量的比较

由图2可知，苜蓿巨大型愈伤组织的丙二醛含量为0.001 406 mol·g-1，松散型的愈伤组织的丙二醛含量为0.001 506 mol·g-1，松散型丙二醛含量比巨大型的丙二醛含量仅仅高出0.000 1 mol·g-1，基本无差异。

2.3 苜蓿两种类型愈伤组织可溶性糖含量的比较

由图3可知，巨大型细胞愈伤组织的可溶性糖含量是0.56%，松散型愈伤组织的可溶性糖含量为1.17%，松散型愈伤组织比巨大型高0.61个百分点，是巨大型的2.09倍，两者有较大的差异。这一结果与霍合强[10]的报道一致。

比较两种愈伤组织的形态解剖结构（图1、2）可以看出，巨大型愈伤组织的细胞中含有中央大液泡，液泡化程度远远高于松散型愈伤组织，细胞质浓度相对来说较低。而松散型愈伤组织细胞中仅有一些小液泡，细胞质浓，在细胞中占的比例大。这可能是巨大型愈伤组织细胞中可溶性糖含量低的原因之一。

2.4 苜蓿两种类型愈伤组织中POD酶活性比较

由图4可知，巨大型愈伤组织细胞的POD酶活性是6 623.7 U·g-1·min-1，松散型愈伤组织细胞的POD酶活性是4 888.7 U·g-1·min-1，巨大型愈伤组织细胞POD酶活性是松散型的1.35倍，差异较大。

过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。过氧化物酶常作为组织老化的一种生理指标[11]。

所以，巨大型愈伤组织细胞的POD酶活性高，表明其组织较松散型愈伤组织老化或衰老程度高。图1、2的愈伤组织形态结构也表明，巨大型愈伤组织的细胞液泡化程度和细胞的分化程度均较松散型的高，细胞也较大，细胞质稀薄、细胞质浓度较低，叶绿体等细胞器也较少，代谢活跃程度较低。

总之，巨大型和松散型这两种类型的愈伤组织在细胞膜透性和丙二醛含量上没有显著差异，但在可溶性糖含量和POD酶活性两项指标上差异比较大，其中松散型愈伤组织的可溶性糖积累高于巨大型，POD酶活性低于巨大型愈伤组织，即巨大型愈伤组织碳水化合物的积累较少，细胞的衰老程度较高。因此，松散型愈伤组织是代谢更加旺盛的愈伤组织。

3 结论与讨论

巨大型和松散型这两种类型的愈伤组织的细胞膜透性差异不大（54%～55%），与两者均为薄壁细胞，且膜代谢反应基本相同有关。

比较两种愈伤组织的形态结构（图1、2）可以看出，松散型愈伤组织细胞呈浅白或白色，半透明，细胞壁薄；巨大型愈伤组织细胞呈浅黄色，细胞较大，细胞壁薄。此外，两种愈伤组织的膜脂过氧化产物丙二醛含量也无差异。说明两者的生物膜完好程度或生物膜受外界影响的程度也相同。因为丙二醛是膜脂过氧化的终产物之一，其含量高低可以作为考察细胞受到胁迫严重程度的指标之一，它的主要伤害是导致膜脂过氧化[12]，损伤生物膜结构，主要是细胞质膜，使得细胞膜结构和功能受到损伤，改变膜的通透性，从而影响一系列生理生化反应的正常进行。因此，两种愈伤组织的细胞膜透性和丙二醛含量均相同，较一致地说明了两种愈伤组织膜代谢程度相同，未受到外界的伤害。

参考文献：

[1] 江荣翠，彭方仁，谭鹏鹏.滇楸体胚发生及生理生化特性研究[J].林业科技开发，2014，28（1）：25-29.

[2] 张建伟，王军辉，马建伟.粗枝云杉胚性愈伤组织增殖后期的体细胞胚发生方式转变[J].植物生理学报， 2014，50（2）：197-202.

[3] 张云超，杨细燕，何良荣，等.鲁棉6号体细胞胚胎发生过程及植株再生[J].华中农业大学学报，2014，3（2）：22-27.

[4] 靳小翠，李志辉，杨模华，等.马尾松幼胚胚性愈伤组织诱导的研究[J].中南林业科技大学学报， 2010（4）：80-84.

[5] 冀爱青，彭功波.核桃子叶胚性愈伤组织的诱导[J].河南农业科学，2010（7）：86-88.

[6] 李茜，张存旭，秦萍.白皮松胚性和非胚性愈伤组织生理生化特性研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2008，36（8）：151-160.

[7] 苗博瑛，刘艳军，杨静慧.黑莓松散型胚性愈伤组织的诱导[J].山西农业科学，2014，42（3）：209-212，216.

[8] 李家儒，唐晓红，黄鲲，等.红豆杉单细胞克隆的建立[J].生物技术，1996，6（3）：8-10.

[9] 陈超，王桂兰，陈玉斌.红掌不同类型愈伤组织及再生团块生理指标的测定[C]//中国植物生理学会第十次会员代表大会暨全国学术年会论文摘要汇编.开封：中国植物生理与分子生物学学会，河南大学， 2009.

[10] 霍合强，邓秀新.柑桔胚性愈伤组织的诱导、保存和利用[J].植物生理学通讯，2000，36（2）：181-186.

[11] 秦婷婷.油菜子叶衰老时相关酶类、类囊体膜组分与光谱特性的研究[D].成都：四川大学，2006.

[12] 王梅，丁祥，何素兰，等.甘薯不同品种叶片中抗氧化相关活性成分的动态变化研究[J].西华师范大学学报：自然科学版，2012，33（4）：330-337.

2 结果与分析

2.1 苜蓿两种愈伤组织细胞膜透性的比较

由图1可知，苜蓿愈伤组织中巨大型细胞愈伤组织的膜透性为54.30%，松散型细胞的愈伤组织膜透性为54.74%个百分点，仅比巨大型的愈伤组织的细胞膜透性高出0.44个百分点。

2.2 苜蓿两种类型愈伤组织丙二醛含量的比较

由图2可知，苜蓿巨大型愈伤组织的丙二醛含量为0.001 406 mol·g-1，松散型的愈伤组织的丙二醛含量为0.001 506 mol·g-1，松散型丙二醛含量比巨大型的丙二醛含量仅仅高出0.000 1 mol·g-1，基本无差异。

2.3 苜蓿两种类型愈伤组织可溶性糖含量的比较

由图3可知，巨大型细胞愈伤组织的可溶性糖含量是0.56%，松散型愈伤组织的可溶性糖含量为1.17%，松散型愈伤组织比巨大型高0.61个百分点，是巨大型的2.09倍，两者有较大的差异。这一结果与霍合强[10]的报道一致。

比较两种愈伤组织的形态解剖结构（图1、2）可以看出，巨大型愈伤组织的细胞中含有中央大液泡，液泡化程度远远高于松散型愈伤组织，细胞质浓度相对来说较低。而松散型愈伤组织细胞中仅有一些小液泡，细胞质浓，在细胞中占的比例大。这可能是巨大型愈伤组织细胞中可溶性糖含量低的原因之一。

2.4 苜蓿两种类型愈伤组织中POD酶活性比较

由图4可知，巨大型愈伤组织细胞的POD酶活性是6 623.7 U·g-1·min-1，松散型愈伤组织细胞的POD酶活性是4 888.7 U·g-1·min-1，巨大型愈伤组织细胞POD酶活性是松散型的1.35倍，差异较大。

过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。过氧化物酶常作为组织老化的一种生理指标[11]。

所以，巨大型愈伤组织细胞的POD酶活性高，表明其组织较松散型愈伤组织老化或衰老程度高。图1、2的愈伤组织形态结构也表明，巨大型愈伤组织的细胞液泡化程度和细胞的分化程度均较松散型的高，细胞也较大，细胞质稀薄、细胞质浓度较低，叶绿体等细胞器也较少，代谢活跃程度较低。

总之，巨大型和松散型这两种类型的愈伤组织在细胞膜透性和丙二醛含量上没有显著差异，但在可溶性糖含量和POD酶活性两项指标上差异比较大，其中松散型愈伤组织的可溶性糖积累高于巨大型，POD酶活性低于巨大型愈伤组织，即巨大型愈伤组织碳水化合物的积累较少，细胞的衰老程度较高。因此，松散型愈伤组织是代谢更加旺盛的愈伤组织。

3 结论与讨论

巨大型和松散型这两种类型的愈伤组织的细胞膜透性差异不大（54%～55%），与两者均为薄壁细胞，且膜代谢反应基本相同有关。

比较两种愈伤组织的形态结构（图1、2）可以看出，松散型愈伤组织细胞呈浅白或白色，半透明，细胞壁薄；巨大型愈伤组织细胞呈浅黄色，细胞较大，细胞壁薄。此外，两种愈伤组织的膜脂过氧化产物丙二醛含量也无差异。说明两者的生物膜完好程度或生物膜受外界影响的程度也相同。因为丙二醛是膜脂过氧化的终产物之一，其含量高低可以作为考察细胞受到胁迫严重程度的指标之一，它的主要伤害是导致膜脂过氧化[12]，损伤生物膜结构，主要是细胞质膜，使得细胞膜结构和功能受到损伤，改变膜的通透性，从而影响一系列生理生化反应的正常进行。因此，两种愈伤组织的细胞膜透性和丙二醛含量均相同，较一致地说明了两种愈伤组织膜代谢程度相同，未受到外界的伤害。

参考文献：

[1] 江荣翠，彭方仁，谭鹏鹏.滇楸体胚发生及生理生化特性研究[J].林业科技开发，2014，28（1）：25-29.

[2] 张建伟，王军辉，马建伟.粗枝云杉胚性愈伤组织增殖后期的体细胞胚发生方式转变[J].植物生理学报， 2014，50（2）：197-202.

[3] 张云超，杨细燕，何良荣，等.鲁棉6号体细胞胚胎发生过程及植株再生[J].华中农业大学学报，2014，3（2）：22-27.

[4] 靳小翠，李志辉，杨模华，等.马尾松幼胚胚性愈伤组织诱导的研究[J].中南林业科技大学学报， 2010（4）：80-84.

[5] 冀爱青，彭功波.核桃子叶胚性愈伤组织的诱导[J].河南农业科学，2010（7）：86-88.

[6] 李茜，张存旭，秦萍.白皮松胚性和非胚性愈伤组织生理生化特性研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2008，36（8）：151-160.

[7] 苗博瑛，刘艳军，杨静慧.黑莓松散型胚性愈伤组织的诱导[J].山西农业科学，2014，42（3）：209-212，216.

[8] 李家儒，唐晓红，黄鲲，等.红豆杉单细胞克隆的建立[J].生物技术，1996，6（3）：8-10.

[9] 陈超，王桂兰，陈玉斌.红掌不同类型愈伤组织及再生团块生理指标的测定[C]//中国植物生理学会第十次会员代表大会暨全国学术年会论文摘要汇编.开封：中国植物生理与分子生物学学会，河南大学， 2009.

[10] 霍合强，邓秀新.柑桔胚性愈伤组织的诱导、保存和利用[J].植物生理学通讯，2000，36（2）：181-186.

[11] 秦婷婷.油菜子叶衰老时相关酶类、类囊体膜组分与光谱特性的研究[D].成都：四川大学，2006.

[12] 王梅，丁祥，何素兰，等.甘薯不同品种叶片中抗氧化相关活性成分的动态变化研究[J].西华师范大学学报：自然科学版，2012，33（4）：330-337.