华潇潇，陈洁琳，张莉莉，周 舸，伍伟军，袁福利，冯鉴强，莫利求

(中山大学1.附属第一医院黄埔院区麻醉科，广东广州 510700;2.中山医学院生理学教研室，广东广州 510080)

右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，主要作为镇静药应用于 ICU和麻醉患者，其还具有神经保护作用［1－2］。值得注意的是，近年有研究证实DEX具有抗炎症作用。例如，DEX 在临床上能改善败血症病人的炎症反应，并能改善患者的预后［3］。在大鼠的小胶质细胞［4］和巨噬细胞［5］，DEX 能抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起的炎症反应。但是，DEX能否抑制缺氧引起的神经炎症，尚未见报道。

缺氧是临床上引起神经损伤的重要因素之一。缺氧可引起氧化应激与炎症反应。最近，我们证实，化学性低氧可通过活性氧(reactive oxygen species，ROS)激活的p38丝裂原激活蛋白酶激酶(MAPK)通路诱发具有神经元结构与功能特征的PC12细胞炎症反应［6］，并证实DEX可以通过抑制p38MAPK通路保护PC12细胞对抗化学缺氧性损伤。因此，我们推测DEX可能通过抑制炎症反应来保护PC12细胞对抗化学缺氧性损伤。为此，本研究应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理PC12细胞建立化学性缺氧损伤的细胞模型，重点探讨:①DEX能否抑制化学性缺氧引起的炎症反应;②DEX抑制炎症的作用是否与其减轻细胞损伤与抗氧化应激有关，以进一步阐明抑制炎症反应在DEX保护PC12细胞对抗缺氧性损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 DEX由江苏恒瑞医药股份有限公司提供。CoCl2购自美国Sigma Aldrich公司，CCK-8试剂盒购自日本Dojindo Lab，DMEM高糖培养基和胎牛血清购自Hyclone公司。IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，TNF-ɑ ELISA试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司。

1.2 细胞培养和实验分组 PC12细胞由中山大学实验室动物中心提供，在37℃、5%CO2的条件下培养于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，2～3 d换液1次。选取对数生长期的细胞进行实验。根据实验目的，实验分6组:① 正常对照组;②CoCl2损伤组:600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12 细胞24 h;③ DEX+CoCl2组:0.1 μmol·L－1DEX 与600 μmol·L－1CoCl2共处理PC12细胞24 h;④ NAC+CoCl2组:500 μmol·L－1NAC 预处理 PC12 细胞 60 min 后，用 600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12 细胞 24 h;⑤ DEX 对照组:单独予以0.1 μmol·L－1DEX 处理PC12细胞24 h;⑥ NAC对照组:单独予以500 μmol·L－1NAC预处理PC12细胞60 min。

1.3 细胞存活率的检测 取对数生长期的PC12细胞，以 1×107接种于 96孔板，100 μl/孔。在37℃、5%CO2条件下常规培养过夜，按照上述实验要求处理完后，每孔加入100 μl 10%的 CCK-8，37℃孵育1 h，用酶标仪(λ=450 nm)测定各孔吸光度(OD)。取4孔OD值的平均数，按照下列公式计算细胞存活率:细胞存活率/%=处理组OD/对照组OD×100%，重复5次。

1.4 IL-1β、IL-6和 TNF-ɑ 水平的检测 采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测培养液中IL-1β、IL-6和TNF-ɑ水平。PC12细胞以1×107接种于96孔板中，100 μl/孔，当80%融合时，分别给予各组处理因素，每组3个复孔。按实验要求处理完成后，收集培养基留作待测标本。ELISA操作根据试剂盒说明书进行，显色反应终止后，用酶标仪(λ=450 nm)测定各孔吸光度(OD)。取3孔OD值的平均数，按照下列公式计算 IL-1β、IL-6和 TNF-ɑ的诱导释放率%:处理组OD/对照组OD×100%，重复5次。

1.5 统计学处理 实验数据用SPSS 13.0软件进行统计分析，所有结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较用Bonferroni检验。

2 结果

2.1 DEX抑制CoCl2诱导的细胞炎症因子的释放Fig 1 显示，600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12 细胞24 h，可使细胞产生炎症反应，与正常对照组相比较，IL-1β的水平升高至(445.8±38.4)%(P＜0.01)，IL-6和 TNF-ɑ水平分别升高为(231.1±20.0)%和(236.7±11.3)%(P值均＜0.01)。但是，当给予 0.1 μmol·L－1DEX 与 CoCl2共处理PC12细胞24 h后，CoCl2诱导的炎症因子释放被抑制，其中IL-1β的释放率降至(147.5±16.1)%(Fig 1A)，IL-6(Fig 1B)和 TNF-ɑ(Fig 1C)分别降至(144.8±7.5)%和(157.3±10.4)%，与CoCl2损伤组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

Fig 1 Dexmedetomidine(DEX)protects PC12 cells against upregulation of levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α induced by CoCl2(n=5)

2.2 ROS清除剂NAC抑制CoCl2诱导的细胞炎症因子的释放 Fig 2显示，与DEX的抗炎症作用相似，CoCl2处理 PC12细胞前 60 min，应用 500 μmol·L－1NAC(为 ROS清除剂)预处理 PC12细胞，也能抑制CoCl2对 IL-1β、IL-6和 TNF-ɑ分泌的上调作用，其中IL-1β的水平降至(301.9±20.6)%(Fig 2A)，IL-6水平降低至(171.7±22.3)%(Fig 2B)，TNF-ɑ 水平降至(194.2 ±53.36)%(Fig 2C)，与CoCl2损伤组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。单独NAC处理对PC12细胞的上述炎症因子的基础分泌无明显的影响。

Fig 2 N-acetyl-L-cysteine(NAC)protects PC12 cells against upregulation of IL-1β，IL-6 and TNF-α induced by CoCl2(n=5)

2.3 DEX和NAC抑制CoCl2诱导的细胞毒性作用 Fig 3显示，600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12 细胞24 h后，产生明显的细胞毒性，使细胞存活率降低至(48.9 ± 5.9)%(P＜ 0.01)，0.1 μmol·L－1DEX 与600 μmol·L－1CoCl2共处理 PC12 细胞 24 h后，PC12细胞存活率升高至(77.8±8.0)%，与CoCl2损伤组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)此外，NAC 预处理 60 min 也抑制 600 μmol·L－1CoCl2引起的细胞毒性(Fig 3)，使细胞存活率升高至(62.0±6.6)%(P＜0.05)。

Fig 3 Effects of dexmedetomidine(DEX)and N-acetyl-L-cysteine(NAC)on CoCl2-induced cytotoxicity in PC12 cells(n=5)

2.4 IL-1β、IL-6 和 TNF-α中和抗体抑制 CoCl2引起的细胞毒性作用 为了探讨炎症因子在CoCl2引起的细胞毒性中的作用，本研究分别观察IL-1β、IL-6和TNF-α中和抗体对CoCl2引起的细胞毒性的影响。Fig 4 显示，分别给予 100 μg·L－1IL-1β、IL-6和TNF-α中和抗体，与CoCl2共处理PC12细胞24 h后，均使细胞存活率明显升高，其中，IL-1β中和抗体组，细胞存活率升高至(84.0±8.0)%(P＜0.01)，IL-6中和抗体组细胞存活率升高至(76.5±9.0)%(P＜0.01)，TNF-α中和抗体组细胞存活率升高至(68.2±3.8)%(P＜0.05)。

3 讨论

Fig 4 Effects of neutralizing antibodies of IL-1β，IL-6 and TNF-α on CoCl2-induced cytotoxicity in PC12 cells(n=5)

临床上，缺氧、缺血是多种疾病，如脑中风(stroke)引起神经细胞损伤的重要的病理生理机制之一。缺氧可诱发氧化应激反应［1，6－7］及炎症反应［6，8－9］。在缺血、缺氧损伤的脑组织中，前炎症细胞因子如IL-1β和IL-6水平升高［8］。IL-1β可通过诱导凋亡蛋白(Bax)基因的大量表达，最终导致神经元凋亡［10］。IL-1β的表达高低通常反映了缺血的严重程度。脑缺血后，缺血局部产生TNF-α和IL-1β等炎症因子，从而激活脑血管内皮细胞表达黏附分子，进而导致白细胞浸润及血栓形成，更进一步加重缺血、缺氧。本研究再次证实，化学性低氧可引起PC12细胞产生明显的炎症反应，导致IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高，这与Lan等［6］的报道相一致。

为了进一步探讨炎症反应与缺氧引起的细胞毒性的关系，本研究观察了IL-1β、IL-6和TNF-α中和抗体对CoCl2(为化学性低氧模拟剂)引起的PC12细胞毒性［1，6－7］的影响。研究结果表明，上述 3 种炎症因子的中和抗体均能明显的抑制化学性低氧引起的细胞毒性，使细胞存活率增多，提示炎症反应参与化学性低氧引起的PC12细胞损伤。

值得注意的是，本研究率先证实α2肾上腺能受体激动剂DEX能明显的抑制CoCl2引起的炎症反应，使PC12细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α明显减少。近年，在多种实验模型观察到DEX具有抗炎症作用［4－5］。例如，Peng 等［4］报道，DEX 能减少 LPS诱导小胶质细胞IL-1β和TNF-α的释放。在离体的全血实验，Kawasaki等［11］也证实，DEX 能抑制 LPS诱导的人全血炎症反应。在败血症大鼠，DEX能减轻内毒素引起的炎症反应［12］。上述的研究均支持本文的结果。结合我们前期的研究［1－2］和本文的上述结果(3种炎症因子中和抗体能抑制低氧引起的细胞毒性)，提示，抑制炎症反应可能是DEX的神经保护作用的机制之一。因此，对于可能存在缺氧的神经损伤患者，如脑外伤、脑中风等，及时应用DEX是需要考虑的，一方面DEX具有镇静、抗焦虑作用，另一方面具有抗炎症作用，并有利于促进受损神经细胞的恢复。Tasdogan等［13］证实，在腹部手术后发生严重败血症的患者，静脉注射DEX能抑制炎症反应及降低腹内压。这值得临床医生进一步探讨。

低氧诱导的炎症反应在某些特殊疾病的发生发展中具有重要作用。在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征，由于间歇低氧而引发系统性炎症反应从而导致血管内皮功能障碍和动脉粥样硬化［15］。对于围术期病人而言，其遭受低氧的机率较高，在某些特殊病人如老年人，低氧诱发的中枢神经系统炎症反应有可能导致术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)的发生，同时也可能加重与炎症有关的中枢神经系统疾病(如唐氏综合症、老年痴呆症和多发性硬化等)。因此，研究减轻低氧诱导的炎症反应具有较重要的临床意义。

目前，有关DEX抗炎症的分子机制的报道很少。有报道指出，DEX的抗炎作用可能与激活α2-肾上腺素能受体及抑制核因子-κB(NF-κB)有关［11］。另有研究证实，在脑缺血/再灌注损伤的大鼠，DEX具有抗氧化作用，使丙二醛(MDA)水平降低，超氧化物歧化酶(SOD)增多［14］。最近，我们也证实DEX能降低化学性低氧引起的活性氧(ROS)水平升高［1－2］。有意义的是，本研究观察到，ROS清除剂NAC也能抑制化学性低氧引起的PC12细胞炎症反应，提示ROS介导低氧引起的炎症反应，通过抑制ROS生成可能是DEX抑制炎症反应的一个重要机制。

综上所述，本研究为阐明α2肾上腺素能受体激动剂DEX抑制化学性低氧引起的神经细胞炎症与细胞毒性提供了新颖的实验资料，为临床应用DEX防治神经炎症反应提供新思路。

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