RNA干扰下调PLK1基因对恶性黑素瘤细胞侵袭和失巢凋亡的影响

2014-11-28丁克云徐娟满昌峰范钰

中华皮肤科杂志 2014年6期

丁克云徐娟满昌峰范钰

丁克云徐娟满昌峰范钰

目的探讨RNA干扰技术下调PLK1基因对恶性黑素瘤细胞侵袭的影响和可能机制。方法用PLK1小干扰核糖核酸分子(siRNA)转染人恶性黑素瘤A375细胞后,分别用实时定量PCR和Western印迹法检测PLK1mRNA和蛋白表达,Transwell方法检测细胞侵袭能力,以平板集落形成方法了解癌细胞集落形成情况,分别用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测癌细胞失巢凋亡情况。结果恶性黑素瘤A375细胞经PLK1 siRNA转染后,PLK1 mRNA和蛋白表达明显下调;siRNA转染组癌细胞生长明显受到抑制。与空白对照组和脂质体对照组比较,siRNA细胞转染组侵袭性明显下降。失巢凋亡检测发现,琼脂糖凝胶电泳出现明显的梯度图谱。TUNEL结果显示,PLK1 siRNA可诱导恶性黑素瘤A375细胞凋亡,siRNA细胞转染组较空白对照组和脂质体对照组凋亡指数明显升高[3.86%±0.35%(3.125 nmol/L siRNA组),7.35%±0.36%(6.250 nmol/L siRNA组),17.56%±0.38%(12.500 nmol/L siRNA组)比1.15%±0.25%和1.18% ±0.22%),均P＜0.01]。结论PLK1 siRNA可抑制恶性黑素瘤细胞的侵袭,其机制可能与诱导失巢凋亡有关。

黑色素瘤;RNA干扰;基因,PLK1;肿瘤浸润

作者单位:212002江苏镇江,江苏大学附属人民医院肿瘤研究所

PLK1是哺乳类Polo激酶家族的重要成员之一。研究发现,PLK1在有丝分裂指数增高的细胞和组织中如恶性肿瘤中表达增高[1-4]。有学者发现,PLK1在黑素瘤组织和细胞中表达明显增高[5-6],提示PLK1基因在恶性黑素瘤发生发展中具有重要的作用,但尚不清楚PLK1基因在恶性黑素瘤增殖和侵袭中的内在机制。本研究用RNA干扰(iRNA)技术,针对PLK1设计合成小干扰核糖核酸分子(siRNA)转染处理人恶性黑素瘤A375细胞,观察对细胞侵袭和失巢凋亡的影响。

材料与方法

一、材料

人恶性黑素瘤A375细胞产自南京凯基生物科技有限公司,本院组织细胞生物标本库冻存。PLK1 siRNA序列:正向:5'-GAGGAGGCUGAGGAUCCUG TT-3',反向:5'-CAGGAUCCUCAGCCUCCUCTT-3',目标位点1253-1273,与已知人类基因组序列无重复,由美国罗氏公司合成高纯度的21nt寡核苷酸siRNA。PLK1抗体产自美国 Santa Cruz公司。TRIzol、RNase抑制剂、反转录酶 SSRTⅡ、Taq 酶、转染试剂Oligofectamine均产自美国Invitrogen公司。DNA抽提试剂盒产自上海申能博彩公司。

二、方法

1.细胞培养及转染处理:恶性黑素瘤A375细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液,37℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前1天,将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板,1 ml/孔,培养过夜。次日进行转染。操作按说明书进行。分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组(10%胎牛血清的RPMI 1640中含已用脂质体包埋PLK1基因siRNA)3个组。

2.PLK1基因检测:①mRNA水平检测:用实时定量PCR检测。用TRIzol抽提细胞总RNA,取总RNA 1 μg,以oligo dT为引物逆转录合成cDNA第一链,以此cDNA链2 μl为模板进行PCR扩增,步骤参照说明书。引物序列:上游:5'-CAAGCTCATC TTGTGCCCACT-3';下游:5'-GAGAAAGGGCTGCC AGGC-3'。FAM 探针:5'-CCGCTTCTCGTCGATGTA GGTCACG-3'-TAMRA。以GAPDH为内参。PCR反应条件为:95℃,预变性3min,95℃、30 s;52℃、45 s;72℃、45 s;35个循环后72℃再延伸7min;②蛋白水平检测:转染48 h后,提取各实验组细胞总蛋白,蛋白定量后,以β肌动蛋白为内参照,进行Western印迹法检测。

3.集落形成试验:用集落形成方法检测。主要步骤如下:①细胞消化、计数、配制成浓度为1×103个/ml的细胞悬液,6孔细胞培养板中每孔加入1 ml细胞悬液(每孔1×103个细胞);②6孔细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养14 d;③弃去培养基,PBS清洗细胞2次后,加入甲醇1 ml/孔,固定15min后,弃去固定液,以流水缓慢冲洗干净,每孔加入l ml的姬姆萨液染色30min,以流水缓慢洗去染色液,通风橱中干燥,显微镜下观察计数。

4.体外侵袭试验:根据文献[7]方法,用Transwell方法检测。细胞计数:用棉签擦去基质胶和上室内的细胞,移去Transwells,倒置,风干,24孔板中加入500 μl含0.1%结晶紫,将小室置于其中,使膜浸没在培养基中,37℃、30min后取出,PBS清洗,直径上取4个视野,照相,计数。

5.细胞失巢凋亡检测:①失巢凋亡模型制备:以铺有多聚-HEMA的培养皿作为失巢凋亡模型。按照文献[8]制备该模型。简述如下,将多聚HEMA溶于无水乙醇,制备成10mg/ml的多聚-HEMA溶液。将培养皿用PBS洗3遍,然后加上2 ml多聚-HEMA溶液包被;②细胞处理:收集转染48 h的细胞,吹打均匀,制成5×105细胞/ml的单细胞悬液。将2 ml细胞接种于多聚HEMA的培养皿中,放入培养箱中继续培养。12 h后,收集细胞,分别用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL检测细胞失巢凋亡;③琼脂糖凝胶电泳;用DNA抽提试剂盒按照说明书操作提取DNA,无水乙醇沉淀。25℃琼脂糖凝胶电泳,电压60 V,1.5 h。用MPIAS-1000多媒体病理图文分析系统进行吸光度测定;④TUNEL检测:盖玻片上细胞用多聚甲醛固定,室温1 h。用PBS洗涤盖玻片,然后在破膜固定液(permeabilization solution)冰上孵育2min。盖玻片上加50 μl TUNEL反应液,37℃孵育1 h。最后,光镜下观察。TUNEL阳性(凋亡)细胞呈亮绿色。凋亡指数(%)=凋亡细胞/细胞总数×100%。

结果

一、siRNA转染对PLK1 mRNA和蛋白水平影响

用PLK1 siRNA转染恶性黑素瘤A375细胞后,分别采用定量PCR和Western印迹检测PLK1基因mRNA和蛋白水平。结果发现,与对照组细胞比较,siRNA组PLK1基因mRNA水平明显下调,差异有统计学意义(P＜0.01),见表1。Western印迹结果显示,与空白对照组比较,PLK1蛋白水平明显下调,见图1。

二、PLK-1 siRNA转染对癌细胞集落的影响

下调PLK-1表达后,对锚着不依赖性增殖和癌细胞穿越基质能力的影响。结果显示,A375细胞在体外半固体培养体系中可以自发地形成集落。而经siRNA转染的细胞集落生长呈剂量依赖性减少。当siRNA 浓度为 3.125、6.250、12.500 nmol/L 时集落数分别为52±5、36±6、17±5、与空白对照组对照组集落数78±6比较,siRNA组软琼脂集落形成数明显降低(P＜0.05)。

表1 siRNA对恶性黑素瘤A375细胞PLK1 mRNA水平的影响(±s,%)

注:n=3

组别 24 h 48 h 72 h空白对照组 100±1.5 100±1.3 100±1.2脂质体对照组 100±1.3 100±1.2 100±1.1 siRNA组3.125 nmol/L 61.8±2.1 49.5±1.9 40.8±1.6 6.250 nmol/L 45.6±1.8 35.8±1.5 26.5±1.7 12.500 nmol/L 29.6±1.6 18.1±1.3 8.9±1.2

三、PLK-1 siRNA转染对癌细胞侵袭的影响

收集转染48 h的细胞,用Transwell方法检测癌细胞侵袭情况。结果发现,当siRNA浓度为3.125、6.250、12.500 nmol/L时穿膜细胞数分别为39±5、19±5、9±3,与空白对照组组56±5比较,siRNA组穿过滤膜的细胞数明显下降(P＜0.01)。

图1 siRNA对恶性黑素瘤A375细胞PLK1蛋白的抑制(48 h)

图2 PLK1 siRNA对恶性黑素瘤细胞DNA梯形条带的影响(48 h) M:标准参照物;1:空白对照组;2:脂质体对照组;3:siRNA 6.25 nmol/L

表2 PLK1 siRNA对恶性黑素瘤A375细胞凋亡指数的影响(±s)

注:n=3

组别凋亡指数(%)空白对照组 1.15±0.25脂质体对照组 1.18±0.22 siRNA转染组3.125 nmol/L 3.86±0.35 6.250 nmol/L 7.35±0.36 12.500 nmol/L 17.56±0.38

四、siRNA对癌细胞抗失巢凋亡的影响

A375细胞无论是贴壁培养时还是在铺在多聚HEMA的培养皿上培养均未见明显的凋亡现象,说明A375细胞具有一定的抗失巢凋亡的特性。将转染后的癌细胞转到铺有多聚HEMA的培养皿上,9 h后收集细胞,分别用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL检测。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,与空白对照组、脂质体对照组比较,siRNA转染组明显增强,空白对照组、脂质体对照组和siRNA组吸光度值分别为(18 620±1 120、17 880±1 250和118 116±2 520。见图2。为了解PLK1 siRNA对恶性黑素瘤细胞凋亡的影响,我们用TUNEL方法检测凋亡指数,结果发现,与空白对照组比较,siRNA组凋亡指数明显增高。见表2。

讨论

正常真核细胞,除成熟血细胞外,大多需黏附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活,称为锚着依赖性。肿瘤细胞可以锚着不依赖性增殖。软琼脂形成集落的多少可反映肿瘤细胞锚着不依赖性的特性,且与其恶性程度呈正相关。癌细胞侵袭能力强,则在软琼脂上形成的集落数目多。本研究发现,经PLK1 siRNA处理恶性黑素瘤细胞软琼脂集落数目明显减少;Transwell方法检测发现,经siRNA处理后的恶性黑素瘤细胞穿膜细胞数减少。说明PLK1 siRNA可抑制恶性黑素瘤细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。

癌细胞侵袭是一个复杂的过程,涉及到很多机制。近年来,失巢凋亡抵抗引起人们重视。细胞与细胞外基质脱离黏附接触或者是接触不完全后出现的凋亡现象,被称为失巢凋亡(anoikis)[8-9]。正常上皮细胞或内皮细胞脱离于细胞外基质的联系时会发生失巢凋亡,而大多数来源于上皮或内皮的肿瘤细胞则丧失了这种特性,尤其是容易发生转移的恶性肿瘤细胞,可以迁徙到其他部位再次生长。这种存在于某些肿瘤细胞的抗失巢凋亡现象,是肿瘤获得转移增殖功能特性的重要原因之一[10]。同样地,恶性黑素瘤细胞在体内增殖转移可能是失巢凋亡抵抗的结果[11]。有学者研究发现,某些癌基因参与了一些恶性肿瘤抗失巢凋亡的调控[9-11]。但目前尚不了解PLK1基因与恶性黑素瘤细胞抗失巢凋亡的关系。

研究失巢凋亡现象一般在包被有多聚HEMA的petri-dish培养皿上进行。多聚HEMA是一种阴离子聚合物,具有均匀的非离子特性,铺在容器的底部可阻止细胞接触和ECM的沉淀,可阻止细胞贴壁,细胞呈悬浮状态,从而诱发失巢凋亡。本研究发现,A375细胞无论是贴壁培养时还是在铺有多聚HEMA的培养皿上培养均未见明显的凋亡现象,即表现为抗失巢凋亡。本研究将不同浓度的PLK-1 siRNA转染处理恶性黑素瘤细胞后,转到包被有多聚HEMA的petri-dish培养皿中培养。于不同时间收集细胞,分别采用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL检测。琼脂糖凝胶电泳显示,基因组DNA凝胶电泳显现明显的梯状图谱。凋亡指数结果显示,转染组细胞凋亡指数明显增高,且呈浓度依赖性。提示PLK-1 siRNA增强了癌细胞对失巢凋亡的敏感性。

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2013-07-01)

(本文编辑:吴晓初)

Impacts of RNA interference targeting the polo-like kinase-1 gene on the invasion of and anoikis in human malignant melanoma cells

Ding Keyun,Xu Juan,Man Changfeng,Fan Yu.Cancer Institute,Affiliated People's Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang 212002,Jiangsu,China

Fan Yu,Email:yuf36@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of down-regulation of polo-like kinase-1(PLK1)gene by RNA interference(RNAi)on the invasion of a human malignant melanoma cell line A375 and their possible mechanisms.MethodsCultured A375 cells were classified into several groups:blank control group receiving no treatment,liposome group transfected with lipofectamine only,and three siRNA groups transfected with three concentrations of a small interference RNA(siRNA)targeting PLK1 respectively.After additional culture,real time quantitative PCR and Western blot analysis were performed to quantify the expressions of PLK1 mRNA and protein in A375 cells respectively,Transwell invasion assay to evaluate the invasive capacity of A375 cells,agarose gel electrophoresis and terminal deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-biotin nick end labelling(TUNEL)to detect anoikis in A375 cells.The colony-forming capacity was also evaluated for A375 cells.Statistical analysis was carried out by one-factor analysis of variance.ResultsThere was a significant decrease in PLK1 mRNA and protein expressions as well as in colony-forming units in the siRNA groups compared with the blank control group(allP＜0.05).The invasive capacity of A375 cells was significantly inhibited in the siRNA groups with the number of migrating cells in Transwell assay being 39±5,19±5 and 9±3 in A375 cells transfected with 3.125,6.250 and 12.500 nmol/L siRNAs respectively,compared to 56±5 in the blank control group(allP＜0.05).A characteristic DNA ladder was observed on agarose gel electrophoresis in the siRNA(6.250 nmol/L)group.Compared with the blank control group and liposome group,the three siRNA groups showed increased apoptotic index(3.86%±0.35%(3.125 nmol/L siRNA),7.35%±0.36%(6.250 nmol/L siRNA)and 17.56%±0.38%(12.500 nmol/L siRNA)vs.1.15%±0.25%(blank control group)and 1.18%±0.22%(liposome group),allP＜0.05).ConclusionsPLK1 siRNA can inhibit the invasion of malignant melanoma cells,likely by inducing anoikis in these cells.

Melanoma;RNA interference;Genes,PLK1;Neoplasm invasiveness

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.012

江苏省镇江市社会发展基金(SH2013048)

范钰,Email:yuf36@sina.com