钟立鹏，郭 薇，姚 敏，沈 婷，杨 武，黄春洪,2*

(南昌大学 1.基础医学院生物化学教研室; 2.基础医学重点实验室， 江西 南昌 330006)

研究论文

华游蛇PLIγ模拟肽的设计与活性验证

钟立鹏1，郭 薇1，姚 敏1，沈 婷1，杨 武1，黄春洪1,2*

(南昌大学 1.基础医学院生物化学教研室; 2.基础医学重点实验室， 江西 南昌 330006)

目的设计华游蛇血清PLIγ模拟肽并研究其对PLA2抑制作用。方法用RT-PCR方法克隆华游蛇PLIγ基因并测序进行序列比对。基于华游蛇PLIγ序列设计一个长度为19个氨基酸的多肽。利用Auto dock分子对接分析该19肽与sPLA2相互作用，运用琼脂糖平板法验证其对sPLA2的抑制效果，并通过小鼠实验进一步检测其抗sPLA2出血毒性。利用LPS诱导小鼠Raw264.7细胞炎性反应，检测细胞花生四烯酸含量以评价19肽对细胞sPLA2酶活性抑制作用。结果设计得到的华游蛇PLIγ模拟肽序列为PGLPLSYPNGGGGSVAFRS。该19肽较好地抑制蛇毒PLA2 酶活性和出血毒性，并可以显著减少LPS诱导Raw264.7炎性细胞中花生四烯酸含量，IC50为86.3μmol/L。结论本文设计的华游蛇PLIγ模拟肽，具备了天然PLIγ的活性，具有抗细胞炎性反应和蛇毒出血毒作用。

华游蛇PLIγ，sPLA2，分子对接，炎性反应

在蛇血清中存在一类天然的PLA2抑制剂(phospholipase A2 inhibitor，PLI)，它可以抑制蛇毒PLA2毒性。现已发现，蛇PLI具有 α、β及γ 3种类型，其中PLI γ分布广泛、对蛇毒PLA2抑制活性强而受到广泛关注[1-2]。本实验前期从华游蛇(sinonatrix percarinata)血清中分离得到了一个PLIγ，在所筛选的6种蛇血清中，其PLA2抑制活性最强，可作为广谱型抗炎性反应和抗蛇伤药物的前体[3]。然而，由于大分子蛋白质的强免疫原性和不稳定性，限制了蛋白质药物的开发。基于活性蛋白质序列，设计具有相同功能而免疫原性低、稳定性强的模拟肽，是现代蛋白质药物研究的一个重要方向。本研究依据华游蛇血清PLI γ氨基酸序列，设计其模拟肽，通过分子对接验证模拟肽与PLA2的结合能力，并在酶、细胞和动物水平验证该模拟肽对PLA2抑制活性，为下一步抗炎性反应和抗蛇伤药物的设计及开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

蛇毒及华游蛇(黄山市蛇毒研究所)；蛇毒PLA2(实验室前期纯化)；昆明小鼠(南昌大学实验动物部)；raw264.7细胞(中国科学院细胞库)。Trizol及RT试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；多肽(上海吉尔生化有限公司合成)；花生四烯酸ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特试剂公司)；LPS(Sigma公司)；其他试剂为进口分装及国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 华游蛇PLIγ基因克隆及测序：取新鲜的华游蛇肝脏，液氮碾磨，按照Trizol试剂盒提取总RNA，RT-PCR克隆PLIγ基因。基于基因数据库蛇PLIγ序列，设计PLIγ简并性引物，上游引物：5′-CRCTCATGTAMWTTTGTCACAA-3′，下游引物：5′-T TATTCAGAAGGTGTARTTTTGG-3′(R, M和 W 分别代表 A/G, A/C, A/T)。扩增条件：94 ℃预变性5 min，循环包括：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共30个循环，最后72 ℃ 10 min。0.8%琼脂糖凝胶电泳，取PCR产物测序。

1.2.2 PLIγ氨基酸序列比对与模拟肽设计：从Expasy蛋白数据库(http://www.expasy.ch)下载PLIγ氨基酸序列， EXPASY-ID号为：P82144 (Agkistrodon blomhoffii)，Q9PWI4 (E.quadrivirgata)，C0STK8 (E.climacophora)，D9N4B6(Trimeresurus elegans)，A8I4K9 (Bothrops erythromelas), Q7LZI1(Naja kaouthia)，Q9I8P7(Python reticμlatus)，Q9PU34(Notechis scutatus)，连同测序得到的华游蛇PLIγ序列，导入Genedoc软件进行多序列比对。运用SWISS-MODEL同源建模预测华游蛇PLIγ三级结构，并用UCSF-Chimera软件对比华游蛇PLIγ与其他蛇PLIγ三级结构，具体方法详见[4]。

将以上预测得到的华游蛇PLIγ活性序列，与文献所报道的一个五肽(VAFRS)[5]通过柔性连接肽GGGS连接，形成一个偶联肽。偶联肽经分子对接软件验证后，交多肽公司合成。

1.2.3 Auto dock分析PLIγ模拟肽与PLA2的相互作用：用chem-office软件绘制PLIγ模拟肽结构，并在sybly-xy2.1软件下优化后作为配体；在PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中下载人sPLA2文件(PDB-ID：1KQU)作为受体，在Auto dock软件下对接100次，详细方法见参考文献[6]。

1.2.4 PLIγ模拟肽对sPLA2酶活性抑制作用：采用琼脂糖平板法，通过测量琼脂糖透明圈大小，检测PLIγ模拟肽对蛇毒sPLA2酶活性抑制作用。琼脂糖平板打孔，每孔总体积为40 μL，设阴性对照(0.9%氯化钠注射液)、阳性组(10 μL蛇毒sPLA2)、3个浓度模拟肽组(PLIγ模拟肽浓度为25、50和75 mg/L)。37 ℃孵育8 h，观察水解透明圈的大小，详细方法见参考文献[3]。

1.2.5 小鼠出血毒实验：普通级昆明小鼠(南昌大学动物实验科学部，SCXK2009-0004)，雌雄不拘，体质量20±2 g。随机分为空白组、蛇毒sPLA2组和蛇毒sPLA2+PLIγ模拟肽组。空白组为200 μL 0.9%氯化钠注射液；蛇毒sPLA2组为100 μL蛇毒sPLA2+100 μL 0.9%氯化钠注射液；蛇毒sPLA2+PLIγ模拟肽组为100 μL蛇毒sPLA2+100 μL模拟肽，其中模拟肽的终浓度为100 mg/L。小鼠背部皮下单点注射，24 h后引颈处死，观察其背部皮下的出血斑块大小及出血程度。

1.2.6 PLIγ模拟肽抗PLA2介导的细胞炎性反应：1)LPS诱导Raw264.7炎性细胞：将LPS(终浓度为1 mg/L)加入Raw264.7细胞培养基中诱导细胞炎性反应，具体方法详见参考文献[7]。因为sPLA2是细胞花生四烯酸炎性反应通路中关键酶之一，因此本研究通过RT-PCR检测细胞sPLA2基因表达，以及通过测定花生四烯酸含量来判断细胞炎性反应程度。sPLA2 扩增引物为：上游:5′-GCCGCCGCTGA ATGTTTCGC-3′;下游:5′-ACGCGCATGTCCGGGTG TTT-3′。PCR条件为：94 ℃变性5 min，循环包括94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共30个循环，最后72 ℃ 10 min，PCR产物为135 bp。以β-actin为内参，采用商品化的引物，产物大小443 bp。2%琼脂糖凝胶电泳，通过Quantity-one软件(Bio-rad公司)计算sPLA2与β-actin条带体积(条带面积×吸光度值)，计算不同组sPLA2与内参体积值比值，以评价LPS诱导前后细胞sPLA2表达水平的改变。2)PLIγ模拟肽对Raw264.7炎性细胞花生四烯酸水平影响：以正常细胞为对照，设置LPS刺激组和LPS+PLIγ模拟肽组。在模拟肽保护组中，设置4个浓度水平，即PLIγ模拟肽终浓度分别为20、40、80和100 mg/L。最终收集各组细胞上清，稀释20倍，采用ELISA竞争法检测花生四烯酸的含量，具体操作见试剂盒说明书。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 华游蛇PLIγ基因RT-PCR及测序结果

从华游蛇肝脏中克隆得到了一个新的PLIγ基因，长度为546 bp(图1)。目前已经将该序列上传至NCBI基因数据库(登记号为JN975878.1)。

2.2 PLIγ氨基酸序列比对

在PLIγ氨基酸序列中，发现3段保守区(图2A)，即46HKNCFSSSVCKL57,88PGLPLS[Q/H/Y/F]PNG97和147YNLKGCVSSCP157。88PGLPLSYPNG97为β-turn结构且富含芳香族氨基酸，易与PLA2疏水通道活性区发生结合。华游蛇与澳大利亚虎蛇PLIγ(notechis scutatus)三级结构高度相似(图2B)。

根据以上分析，基于华游蛇PLIγ氨基酸保守序列以及前人报道的蛇毒sPLA2抑制肽VAFRS，通过连接肽GGGS，得到一个19肽序列为PGLPLSYPNGGGGSVAFRS，交上海吉尔生化有限公司合成。

2.3 华游蛇PLIγ模拟肽与PLA2分子对接结果

华游蛇PLIγ模拟肽与PLA2的模拟对接(图3)，从表面模型图可见，19肽最低能量结构位于人sPLA2疏水通道内，结合能为-10.76 kcal/mol(图3A)，该19肽嵌于sPLA2蛋白疏水通道中，与Gly32、Lys62形成氢键(黄色虚线表示)。

A.agarose electrophoresis of PLIγ; B.nucleotide and amino acid sequence of sinonatrix percarinata PLIγ图1 华游蛇PLIγ基因克隆及序列分析Fig 1 Cloning of sinonatrix percarinata PLIγ gene and sequence analysis

2.4 华游蛇PLIγ模拟肽对蛇毒PLA2的抑制结果

2.4.1 模拟肽对蛇毒sPLA2酶活性的抑制效果：多肽组透明圈减小，并呈量效关系。19肽在终浓度为75 mg/L，琼脂糖透明圈不明显，面积几乎与空白组相同(图4A)，表明该19肽可以较好抑制蛇毒sPLA2酶活性。19肽在50和75 mg/L浓度水平显著抑制sPLA2的酶活性(图4B)。

A.alignment of PLIγ amino acid sequences; B.structural align of snake PLIγs; blue and yellow stands for notechis scutatus and sinonatrix percarinata PLIγ, respectively

图2华游蛇PLIγ序列比对及三级结构比较
Fig2AminoacidsequencesandtertiarystructurealignmentofSinonatrixpercarinataPLIγ

图3 人sPLA2与19肽的分子对接和相互作用Fig 3 Molecular docking of the 19aa peptide with human sPLA2 and their interactions

A:a.40 μL 0.9% NaCl; b.10 μL sPLA2+30 μL 0.9% NaCl; c～e were 10 μL sPLA2+25 mg/L, 50 mg/L, 75 mg/L 19 aa peptide respectively;*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with control

图419肽对蛇毒sPLA2的抑制效果
Fig4Inhibitioneffectofthedesigned19aapeptideagainstsPLA2enzymaticactivity

A.0.9% NaCl; B.snake venom sPLA2; C.19aa peptide+sPLA2 (×2.5)图5 19肽对sPLA2出血毒性的抑制作用Fig 5 Protective effect of the 19aa peptide against snake venom sPLA2 hemorrhagic toxicity

2.4.2 小鼠出血毒实验结果：蛇毒sPLA2出血毒性实验，0.9%氯化钠注射液组小鼠背部皮下组织完好无损，毛细血管完整，无出血斑及脓肿(图5A)；sPLA2组小鼠背部皮下毛细血管已经大量破裂，出现半径为(1.97±0.15)cm的出血斑块，且斑块上充满黄色的渗透液(图5B)；sPLA2+19肽组小鼠注射点皮下毛细血管少量破裂，出血程度轻，血斑半径为(1.3±0.2)cm(图5C)。

2.5 模拟肽对细胞炎性反应的保护作用

RT-PCR检测LPS刺激前后Raw264.7的sPLA2表达水平，以β-actin为内参。LPS刺激后细胞中sPLA2基因表达显著上调(图6A)。sPLA2是生成花生四烯酸(AA)的重要酶。因此，通过测定AA含量，可以反映模拟肽对细胞sPLA2活性抑制效果。ELISA结果(图6B)，LPS刺激后，细胞AA含量显著上升，但加入模拟肽后，随着浓度的提高，细胞AA含量逐渐下降(*Plt;0.05,**Plt;0.01)。通过计算，半数抑制率IC50为86.3 μmol/L。

*Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with LPS图6 LPS诱导后细胞sPLA2基因表达上调及19肽抗炎作用Fig 6 Up-regulation of sPLA2 in LPS treated cells and the anti-inflammatory effect of the 19 aa peptide in the cell trials

3 讨论

sPLA2为花生四烯酸和溶血磷脂通路上游限速酶[8]，被誉为炎性反应通路的总开关，是抗炎药物的重要靶点。目前sPLA2抑制剂主要为植物和海洋来源的天然产物，而蛋白质及多肽类sPLA2抑制剂研究相对较少。天然sPLA2抑制蛋白(PLI)主要来自于蛇血清[9]，而肽类抑制剂也大多是基于蛇PLI进行设计。蟒蛇(python reticulatus)血清中的sPLA2抑制蛋白(phospholipase A2 inhibitor protein, PIP)第55-72位的氨基酸序列LGRVDIHVWDG VYIRGR和第86-98区LPGLPLSLQNGLY具有很高的抑制活性，对小鼠sPLA2的IC50分别为9.4和37.8 μmol/L[10]。后来基于蟒蛇PIP继续设计了一系列的sPLA2抑制肽，最终认为VDIHVWDGV-VDIHVWDGV串联肽的活性最强[11]。已有研究表明，含-OH的Tyr、Ser，碱性氨基酸Arg、Lys，以及疏水氨基酸Leu、Ala、Phe和Val，易于结合和抑制sPLA2疏水性活性中心[5]。采取肽-sPLA2复合物结晶方法，分别设计了5肽LAIYS和VAFRS，并证明二者对蛇毒sPLA2具有抑制作用[5,12]。本研究将华游蛇PLIγ的活性序列与VAFRS串联，设计得到19肽。通过酶、细胞和动物水平的初步研究，该19肽可通过结合sPLA2的活性区而发挥抑制活性。不仅可以抑制蛇毒sPLA2酶活性及出血毒性，而且可抑制小鼠sPLA2活性，显著降低花生四烯酸的产生，具有潜在的药物开发价值。此外，也应开展该19肽与上述多肽的抑制活性的平行对比，并进一步对该19肽进行结构上的优化，以提高其活性。

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Designing of a mimic peptide based on Sinonatrix percarinata PLIγ sequence and determination of its inhibition activity

ZHONG Li-peng1, GUO Wei1, YAO Min1, SHEN Ting1, YANG Wu1, HUANG Chun-hong1,2*

(1.Dept. of Biochemistry, College of Basic Medical Sciences；2.Key Laboratory for Basic Medical Sciences of Nanchang University, Nanchang 330006, China)

ObjectiveTo design a simulating peptide based on Sinonatrix percarinata PLIγ sequence and to explore its inhibitory activity on PLA2.MethodsSinonatrix percarinata PLIγ gene was cloned by RT-PCR and aligned with other published PLIγ sequences. Based on the results, a 19aa peptide was designed based on Sinonatrix percarinata PLIγ. Molecular docking was then achieved to investigate the interaction between the 19aa peptide and sPLA2 by Auto-dock software. Experimental validation was conducted by agarose plate method, and anti-hemorrhagic activity against snake venom sPLA2 on mice skin was tested as well. Arachidonic acid content in LPS induced Raw264.7 cells was assayed to evaluate the 19aa peptide inhibitory effect on mammal sPLA2 enzyme.ResultsThe mimic 19aa peptide with the sequence as PGLPLSYPNGGGGSVAFRS, behaved dominant pharmacological inhibitive properties to enzymatic activity and hemorrhage toxicity of sPLA2. It also significantly reduced arachidonic acid content in the LPS induced Raw264.7 inflammatory cells with an IC50of 86.3 μmol/L, probably by inhibiting the mammal sPLA2.ConclusionsThe 19aa peptide shows similar pharmacological properties with natural Sinonatrix percarinata PLIγ, which indicates its anti-inflammatory and anti-hemorrhage potential.

sinonatrix percarinata PLIγ, sPLA2, molecular docking, inflammatory

2013-01-07

2013-05-24

国家自然科学基金(31260209)；国家大学生创新实验项目(2012174)；江西省自然科学基金(20114BAB215016)

*通信作者(correspondingauthor)： merlynhuang@sina.com

1001-6325(2014)03-0289-06

Q 51

A