罗宇燕，麦海燕，黎 呐，金启星，黄小舟，张永明

(1.中山大学附属第三医院，广东广州 510630;2.中山大学药学院，广东广州 510006）

干扰素 (interferon，IFN)是一种广谱抗病毒剂，目前主要用于治疗慢性乙肝、丙肝等疾病。作为一种蛋白药物，其分子量大，半衰期短，体内外稳定性差，临床上主要的剂型是溶液型注射剂和冻干粉针。注射给药后，药物很快就被清除或降解，为了达到疗效常常需要频繁、大剂量及长时间给药，导致毒副作用及耐受性的产生［1－2］。

使用高分子材料包载蛋白药物制成微球制剂，可达到延长药物作用时间、提高药效的目的。其中，聚乳酸聚乙醇酸 (PLGA)由于具有良好的生物相容性和生物可降解性等特点，成为常用的微球载体［3］。目前最常用的制备蛋白微球的方法是复乳法［4］。而改良法是在复乳法研究的基础上提出的新工艺［5－7］，在微球制备的复乳和固化阶段，内水相的海藻酸钠 (Sodium alginate，Sa)与外水相中的Ca2+相互渗透螯合成海藻酸钙凝胶，并与微球骨架同步形成，无需二次包封，操作简单。本实验以PLGA为载体，分别采用复乳法及其改良法制备IFNα－1b缓释微球，对比了两种方法所得微球的理化性质、内外形态、表面和及骨架内的蛋白分布情况，以及体外释放特性。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

重组人干扰素 α－1b(批号:110301，IFN:1.70 g·L－1，深圳科兴有限公司);海藻酸钠 Protanal LF 200DL(美国FMC公司);聚乳酸聚乙醇酸 (PLGA，LA/GA摩尔比为50∶50，黏度为0.85 dL·g－1，美国伯明翰聚合物公司);micro BCA蛋白定量试剂盒 (美国Pierce公司);FITC－BSA(美国Sigma公司);考马斯亮蓝染色液G－250(碧云天生物研究所);二氯甲烷 (天津市富宇精细化学品有限公司);其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

FA25匀浆器 (上海弗鲁克液体机械制造有限公司);L－550台式低速大容量离心机;GZ强力电动搅拌器 (金坛市医疗仪器厂);ALPHA 1－4 LSC冷冻干燥机 (德国 CHRIST公司);BIO－TEK ELX－800全自动酶标仪 (美国宝特公司);SHA－B水浴恒温振荡器 (江苏省金坛市宏华制造厂);JSM26700F冷场发射扫描电镜 (日本电子公司);EG1160石蜡切片机 (德国徕卡);Leica CM1850冷冻切片机 (德国徕卡);LSM710激光共聚焦显微镜 (德国Zeiss公司)。

2 方法

2.1 干扰素微球的制备

采用复乳法制备IFN－PLGA微球，即将适量的重组IFNα－1b粉末 (理论载药量为1%)溶解于泊洛沙姆188(F68)溶液中，形成均一的内水相，再与一定浓度的PLGA二氯甲烷溶液混合，在冰浴条件下高速匀浆1 min制成初乳 (W/O);将初乳迅速转移至聚乙烯醇 (PVA)水溶液 (外水相1)中，搅拌形成W/O/W型复乳;最后将复乳转移至大体积的PVA水溶液 (外水相2)中，低速搅拌3 h使有机溶剂挥发、微球固化。用蒸馏水洗涤3次，离心收集微球，冻干得微球粉末。

使用改良法制备微球时，在F68溶液中加入Sa粉末，使 Sa在内水相中的质量浓度为12 mg·L－1，外水相1、2中分别加入氯化钙，使其对应质量浓度分别为 30 mg·L－1、5 mg·L－1，其余操作与复乳法一致。

2.2 微球包封率、载药量和产率的测定

精密称定载药微球10 mg，并加入到5.0 mL 0.1 mol·L－1NaOH/5 mg·L－1SDS 溶液中，于 37℃水浴条件下振荡48 h，使微球完全溶解。离心后取上清液，用BCA法测定蛋白含量。背景吸收值用空白微球裂解后的上清液作校正。

2.3 微球的表面及内部形态

2.3.1 微球粒径的测定量 取适量冷冻干燥后的微球，用蒸馏水分散，在光学显微镜下观察微球的外观形态，同时选择有代表性的区域，测定300个粒子，计算平均粒径。

2.3.2 微球形态的测定 将冷冻干燥后的微球或经石蜡切片后的微球切片固定在导电胶上，置于真空条件下，喷上金粉。然后用扫描电子显微镜在电子束强度为10 kV的条件下观察微球的表面形态。

2.3.3 微球表面及截面孔隙率 从每种处方的微球及其切片的扫描电镜图片中选取至少6张，使用Image J软件分析微球及其截面的孔洞数目、孔洞总面积及微球面积，计算微球表面及截面孔隙率［8］。

2.4 蛋白在微球中的分布情况

2.4.1 微球表面的蛋白染色 分别称取复乳法和改良法制备的IFN微球适量于离心管中，各加入适量考马斯亮蓝G－250染色液浸泡5 min，涡旋使微球粉末分散均匀。离心弃上清液后，加入适量蒸馏水洗涤微球4次，冷冻干燥后拍照。

2.4.2 蛋白在微球内的分布情况 将两种方法制备的载荧光蛋白FITC－BSA的微球进行冷冻切片 (厚度约8 μm)，在激光共聚焦显微镜下观察微球截面中蛋白的分布情况。固定吸收波长/激发波长为488/525 nm，放大倍数为400倍。

2.5 微球的体外释放测定

精密称取约50 mg微球置于5 mL离心管中，加入1.5 mL PBS 液 (pH 值为7.4，含有 20 g·L－1的F68)，于37℃水浴振荡器中以100 r/min的振速振荡，分别于不同时间点定时离心过滤，取出上清液，同时补加新鲜的PBS。采用micro BCA微孔板法测定所取样品中的蛋白含量，计算累积释药量，绘制体外释药曲线。分别采用零级、一级方程、Higuchi模型和 Korsmeyer－Peppas方程对释药行为进行拟合。其中，Q代表累计释放百分比，t代表时间，r代表相关系数。

3 结果

3.1 两种制备方法所得微球的理化性质研究

经过前期实验的筛选［5－6］，得到较优的微球制备工艺，分别以复乳法和改良法制备IFN－PLGA微球，所得微球均为流动性良好的白色疏松粉末。其包封率分别为 54.37%，61.85%(P ＜0.05)，载药量为0.6507%，0.7243%(P ＜0.05)，产率为85.27%，85.03%(P ＞0.05)，平均粒径为 73.69 μm，71.04 μm(P ＞0.05)。可见使用改良法制备的微球具有较高的包封率和载药量，制备工艺对产率及平均粒径的影响不显著。

3.2 两种制备方法所得微球的内外形态

对于包载亲水性大分子药物的微球，药物的初期释放主要是通过孔洞扩散，此时微球的表面孔隙率和内部形态特征起着重要的作用［8］。使用扫描电镜对微球表面及截面进行观察 (见图1)，并运用软件分析微球的表面及截面参数。复乳法与改良法的表面孔隙率分别为 7.9%，0.48%(P＜0.05)，表面孔隙个数分别为221，35(P ＜0.05)，截面孔隙率分别为 48.9%，48.1%(P ＞0.05)，截面孔隙个数分别为320，146(P＜0.05)。从外观而言，复乳法制备的微球表面孔洞较大且多，而改良法所得微球光滑圆整，表面孔洞较少且孔径小。截面形态方面，改良法所得微球内部孔洞较大但数目较少，截面孔隙率与复乳法相当。

图1 微球的扫描电镜图Fig.1 Scanning electron micrographs of microsphere

3.3 两种制备方法所得微球的表面蛋白分布量

众所周知，在体内外释放过程中，靠近微球表面的药物最先扩散出来，其中浅表蛋白分布量较多的微球，容易产生突释［9］，有可能导致血药浓度接近或超过中毒水平，产生明显的不良反应。考马斯亮蓝G－250染色液可以专属性地对蛋白染色，游离的G－250与蛋白结合形成蓝色复合物，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比。从染色微球的表面颜色深浅可得知浅表的蛋白分布量［10］，预测微球的突释效应。分别对两种方法制得的IFN微球进行染色，从图2可得改良法所得微球的外观以浅蓝色为主，带有少量深蓝色微粒;而复乳法组微球则均一地呈现深蓝色。说明改良法所得微球的表面蛋白分布量较少。

3.4 蛋白在微球内部的分布情况

使用激光共聚焦显微镜可观察到样品中的荧光物质，从而直观地得到药物在制剂中的分布情况［11－12］。以荧光蛋白 FITC－BSA(激发波长:495 nm;绿色荧光)代替IFN作为模型蛋白制备微球，通过激光共聚焦显微镜对载药微球的切片进行扫描，观察荧光蛋白在不同制备工艺所得微球中的分布情况 (图3)。图中发亮物质为FITC－BSA，亮度越高的地方代表蛋白量越多。可见改良法所得微球的内部分布着大小不均一的孔洞，孔洞之间相对独立，蛋白较多地分布在微球中部和内部;而复乳法所得微球内部孔洞多，且孔隙连通性高，蛋白几乎均匀分布于微球孔壁上。

图3 FITC－BSA微球切片的激光共聚焦显微镜图Fig.3 Laser scanning confocal microscopy pictures of FITC－BSA microspheres slices

3.5 两种制备方法所得微球的体外释放性能的研究

考察两种制备方法所得微球的体外释药行为，分别测定不同时间的释药量，以横坐标为释药时间，纵坐标为累计释药百分比绘制曲线 (图4)，并对体外释放曲线进行拟合。结果可得，复乳法1 d的突释百分比 (37%)大于改良法 (30%)。前者7 d内累积释放达到72%，但此后阶段的释药量少，30 d仅释放79%。而改良法所得微球在2～20 d的范围内以均匀速度释放药物，缓释时间较长，30 d的累积释放接近70%。两法所得微球的释药曲线均符合 Korsmeyer－Peppas方程 (r＞0.97)，分别为 Q=40.397 t0.230，Q=30.147 t0.256。方程指数均小于0.43，提示药物主要以扩散形式释放。

图4 微球的体外释放图Fig.4 Effect of microsphere preparation method on the drug release

4 讨论

本实验在同等条件下对比了改良法与复乳法制备的IFN－PLGA微球的载药特性，包括微球的理化性质、内外形态、微球表面及骨架内的蛋白分布情况，以及体外释放行为。

改良法是在复乳法的工艺基础上，于内水相添加了Sa，外水相添加了氯化钙。该法制备的微球具有较高的包封率和载药量，其表面的蛋白量少、孔洞较少且孔径小。主要原因是由于在微球制备的复乳及固化过程中内外水相相互渗透:外水相中的Ca2+与分散于油相中含Sa的内水相液滴相互螯合，或者Sa液滴往外水相扩散过程中与Ca2+螯合形成海藻酸钙凝胶，一定程度地填充因溶剂挥发在微球内形成的孔隙，使微球表面更为紧密。此外，海藻酸钙凝胶的形成，可减缓内水相液滴中的蛋白药物往外水相扩散，减少微球表面的药物分布量，使更多的蛋白包封于微球中。

从微球截面的扫描电镜图可得，改良法所得微球内部孔洞较大而数目较少，孔径分布不均，总体的截面孔隙率与复乳法相当。这是由于Sa的添加大大增加了内水相的黏度［13］，从而使微球制备过程中内水相液滴大小均匀性下降、液滴更容易破裂融合成更大的液滴，致使干燥后的微球内部呈现大小不一的孔洞，孔洞数目显著少于复乳法制备的微球。

与复乳法相比，改良法可增加微球表面结构致密性，降低浅表蛋白分布量，使微球突释率显著降低，缓释天数由7 d提高到20 d以上。释放过程中溶出介质逐渐渗入微球内部，分布于骨架中的海藻酸钙凝胶慢慢吸水膨胀，一定程度地减慢药物扩散，延长药物释放时间，提高后期药物释放浓度;但30 d内累积释药率稍低于复乳法。除了微球结构紧密、海藻酸钙延缓释药的原因外，可能存在小部分药物与凝胶或载体结合紧密，以至释放缓慢。

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