王春华，王宏军

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121001）

20世纪50年代至今越来越多的医药工作者发现了很多具有抗菌作用的中药和其主要的抗菌成分，成为许多学者们研究的热点。由于甘草、黄连、秦皮、黄柏、金银花的提取物对猪链球菌均有一定的药理活性[1]，故本试验对这5味中药用微量肉汤稀释法进行MIC的测定，以得出不同的提取方法对猪链球菌II型的抑制效果。

1 材料与方法

材料

1.1.1 中药 甘草、黄连、秦皮、黄柏、金银花，购自锦州大药房。

1.1.2 菌种 猪链球菌Ⅱ型由辽宁医学院预防兽医学教研室动物传染病实验室提供。

1.1.3 试剂 葡萄糖营养肉汤培养基，购自金华东南化工仪器有限公司；琼脂粉，购自广州市迪景微生物科技有限公司。

方法

1.2.1 培养基的制备 （1）葡萄糖营养肉汤培养基：15 g营养肉汤培养基加入500 mL蒸馏水，121℃高压灭菌15min，冷藏备用；（2）葡萄糖营养琼脂培养基：15 g营养琼脂培养基加入500mL蒸馏水，121℃高压灭菌15min。放入超净台，当营养琼脂降到50℃～55℃左右时浇平板。待平板内琼脂凝固后，冷藏备用。

1.2.2 试验用药液的制备 （1）醇提取： 先将甘草、黄连、秦皮、金银花、黄柏粉碎，用电子天平分别准确称取10 g，放入烧杯内，再加入70%的乙醇100mL，用超声波提取3次，每次30min，然后将提取物加热浓缩后放入恒温干燥箱中干燥成药膏，再用蒸馏水配成1g/mL的药液，4℃冰箱保存备用[2]；（2）水提取：将甘草、黄连、秦皮、金银花、黄柏粉碎，用电子天平分别准确称取10 g，放入锥形瓶中，再加入适量的蒸馏水浸泡2～3 h，用超声波作用30min，然后用水煎20min，每种药煎2～3次后浓缩成药膏，用蒸馏水稀释到1 g/mL的药液，4℃冰箱保存备用。

1.2.3 MIC的测定 （1）试验用菌液的配制：取100μL猪链球菌Ⅱ型菌种接种在900μL营养肉汤中，放在恒温培养箱中37℃培养18～24 h，得原菌液。取试管分别对原菌液用生理盐水进行10倍稀释并标记，用移液枪从8号管中取20μL菌液注入平板上，并用L棒将其涂匀（重复做3个平板），培养18～24 h后查菌落数，得出原菌液的细菌浓度。再将原菌液或稀释后的菌液用生理盐水稀释到所需浓度猪链球菌Ⅱ型106CFU/mL[3]，4℃冰箱保存备用；（2）MIC的测定：采用微管-平板法。每种药物12支EP管，每个EP管内先加入250μL的肉汤，再向第1支EP管里加入250μL的药液，混匀后从中吸取250μL加入第2支EP试管，依次类推，直至第11支试管，弃去250μL。1～12号EP管内加入20μL菌液，12号EP管不加做阴性对照。37℃培养18～24 h后，将其分别接种到平板上，37℃再培养18～24 h后，得试验药物对猪链球菌Ⅱ型的MIC。

1.2.4 统计学方法分析 运用t检验统计学分析方法对每种药物的醇提物和水提物猪链球菌Ⅱ型的MIC进行分析，找出对猪链球菌Ⅱ型较敏感的提取物。

2 结果与分析

甘草、黄连、秦皮、金银花、黄柏5种药物的不同提取物同一浓度5次重复后对猪链球菌Ⅱ型最小抑菌浓度（MIC）各不相同。

2.1 表1甘草水提物MIC为40.62±20.96mg/mL，甘草醇提物MIC为4.13±1.02mg/mL，表明甘草的醇提物比其水提物对猪链球菌Ⅱ型效果显著(P＜0.05)。

2.2 表2黄连水提物MIC为87.50±34.23mg/mL，黄连醇提物MIC为28.12±6.99mg/mL，表明黄连的醇提物比水提物对猪链球菌Ⅱ型效果显著(P＜0.05)。

表1 甘草不同提取物对猪链球菌Ⅱ型的MIC （mg/mL）

表2 黄连不同提取物对猪猪链球菌Ⅱ型的MIC （mg/mL）

表3 秦皮不同提取物对猪链球菌Ⅱ型的MIC （mg/mL）

2.3 表3秦皮水提物MIC为68.75±34.23mg/mL，秦皮醇提物MIC为175.0±68.47mg/mL，表明秦皮的水提物比其醇提物对猪链球菌Ⅱ型效果显著(P＜0.05)。

2.4 表4金银花水提物MIC为125.00±76.54mg/mL，金银花醇提物MIC为175.0±41.93mg/mL，表明金银花的醇提物和水提物对猪链球菌Ⅱ型效果差异不显著(P＞0.05)。

表4 金银花不同提取物对猪链球菌Ⅱ型的MIC（mg/mL）

2.5 表5黄柏水提物MIC为62.50±38.27 mg/mL，黄柏醇提物MIC为68.75±34.23mg/mL，表明黄柏的醇提物和水提物对猪链球菌Ⅱ型效果差异不显著(P＞0.05)。

表5 黄柏不同提取物对猪链球菌Ⅱ型的MIC （mg/mL）

3 讨论

此试验采用了水提取和醇提取两种方法药物，从试验结果得出不同的提取溶媒对药物的抑菌活性有一定的影响，由表1至表5可看出不同的药物对猪链球菌Ⅱ型的MIC有一定的差别，同一种药物不同的提取方法对猪链球菌Ⅱ型的MIC也不尽相同。从表1可看出，甘草醇提物的效果最理想为4.13mg/mL，而水提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为40.63mg/mL，表明甘草的醇提物对猪链球菌Ⅱ型的体外抑菌效果比其水提物显著(P＜0.01或P＜0.05)。黄连醇提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为28.13mg/mL，显著低于水提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC，为87.50mg/mL(P＜0.01或P＜0.05)。秦皮水提物MIC为68.75mg/mL，秦皮醇提物MIC为175.0mg/mL，表明秦皮的水提物比其醇提物对猪链球菌Ⅱ型效果显著(P＜0.05)。黄柏、金银花的不同提取物对猪链球菌Ⅱ型的抑制作用差异性不显著(P＞0.05)。

4 结论

4.1 甘草水提物对猪链球菌Ⅱ型的抑制作用明显。对本研究的结果进行归纳总结，得出了甘草的水提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为40.63±20.96 mg/mL，黄连水提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为87.50±34.23 mg/mL，秦皮水提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为68.75±34.23mg/mL，金银花水提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为125.0±76.54mg/mL，黄柏水提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为62.50±38.27mg/mL，说明甘草水提物对猪链球菌Ⅱ型的抑制作用明显。

4.2 甘草醇提物对猪链球菌Ⅱ型的抑制作用明显。对本研究结果进行归纳分析，得出甘草的醇提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为4.13±1.02mg/mL，黄连醇提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为28.13±6.99mg/mL，秦皮醇提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为175.0±68.47mg/mL，金银花醇提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为175.0±41.93 mg/mL，黄柏醇提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为68.75±34.23mg/mL，说明甘草醇提物对猪链球菌Ⅱ型的抑制作用明显。

[1]樊骢，刘颖，杨圣辉，等.5种中药水提取物对变异链球菌生长影响的体外研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2011(03)：154-157.

[2]曾莉萍，崔秀琴.中药对幽门螺杆菌的体外联合抗菌实验[J].成都医学院学报，2008(02)：29.

[3]王静，张淑文.中药逆转细菌耐药的研究进展[J].临床和实验医学杂志，2007，6(1)：153.

[4]芦亚君，程宁.3种中药方剂逆转大肠杆菌耐药性的实验观察[J].西北药学杂志，2007，22(6)：309.