摘要：以黑羽番鸭为素材，利用PCR-SSCP技术寻找该群体GH基因单核苷酸多态性（SNPs），并分析SNPs与体质量、屠宰性能的关联性。结果表明，在GH基因第1内含子上发现了A1251C、A1322G、T1378C、G1440A共4个SNP，形成了AA、AB、BB 3种基因型，群体纯合度为0.502 7，多态信息含量为0.373 6。在番鸭早期生长发育过程中，BB型公鸭体质量在不同周龄时处于最高值；在13周龄屠宰时，BB型公鸭的宰前活质量、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量显著高于AA型和AB型（P<0.05）；在内脏组织中，BB型腹脂质量、心质量显著高于AB型（P<0.05）；AA型、AB型、BB型 3种基因型间屠宰指标百分比无显著差异（P>0.05）。母鸭所有指标在3种基因型间均无显著差异（P>005）。这些关联分析表明B基因可能是公鸭早期增重的有利基因，在母鸭上还需进一步验证。

关键词：黑羽番鸭；生长激素基因；体质量；屠宰性能

中图分类号： S834.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0030-04

收稿日期：2013-12-04

基金项目：中国农业科学院家养动物种质资源平台建设项目；江苏省农业三新工程项目[编号：SXGC（2013）361]。

作者简介：王丽华（1972—），女，辽宁营口人，硕士，副教授，主要从事家禽生产与科研工作。E-mail：jstzwlh2008@163.com。目前，水禽生长方面的功能基因研究主要是围绕下丘脑-垂体-生长轴调节过程中的基因。生长激素（growth hormone，GH）是动物垂体前叶合成、分泌的一种单链蛋白类激素，具有种属特异性，在刺激生长、促进代谢、强化其他内分泌激素方面具有重要作用，还对动物生殖功能产生影响[1]。通过对动物（包括人和畜禽）GH基因的深入研究，目前已明晰其基本结构。通常，畜禽GH分子量为21～22 ku，由186～191个氨基酸组成。动物GH基因一级结构主要有如下特点：包括人类在内的灵长类动物中，GH基因拷贝数较多；GH基因主要由5～6个外显子和4～5个内含子所组成，且GH基因的外显子数量和大小存在种间特异性；GH基因的cDNA长度一般为650～1 200 bp。在1988年，Chen等首次克隆获得了820个碱基对的鸭GH基因cDNA序列，编码216个氨基酸，含有1个27个残基的信号肽，该序列与鸡高度同源[2]。2004年GenBank上才有了鸭GH基因全序列的报道，该序列包含了 5 219个碱基对，同样编码216个氨基酸，包含了5个外显子和4个内含子。虽然有了鸭GH基因全序列，但是在各个鸭品种GH基因多态性方面开展的研究工作较少，鉴于此，本试验拟采用PCR-SSCP方法检测黑羽番鸭GH基因序列中潜在的SNPs，并分析不同基因型间体质量、屠宰性能之间的差异，为GH基因功能研究提供参考资料。

1材料与方法

1.1试验对象

试验所用黑羽番鸭由江苏农牧科技职业学院提供，选择健康黑羽番鸭135只进行饲养，其中公鸭70羽，母鸭65羽。在初生（0周龄）及2、4、6、8、10、13周龄时测定禁食6 h后的体质量；10周龄时，从翅静脉采血2 mL，采用肝素钠抗凝，用于提取DNA。13周龄时，对所有黑羽番鸭进行屠宰测定，测定指标为宰前活质量、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量、腿肌质量、胸肌质量、肝质量、心质量、腺肌胃质量、腹脂质量等，用公式计算出相应指标占有的比例。

1.2引物设计

根据GenBank中公布的水禽GH基因序列，设计了多对引物用于检测黑羽番鸭群体中存在的SNPs。引物由生物公司进行合成。试验所用引物序列及信息见表1。表1试验所用引物序列及信息引物名称引物序列（5′→3′）产物长度1.3DNA提取和检测

采用酚/氯仿法抽提黑羽番鸭基因组DNA，并溶于TE中。用核酸浓度测定仪测定其浓度和纯度，然后稀释成100 ng/μL备用。

1.4PCR扩增

PCR反应物组成：10×PCR buffer（不含Mg2+） 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、10 pmol/L上下游引物各1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL，加ddH2O至25 μL。

PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，54～56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5PCR产物检测及分型

PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳，结束后用凝胶成像系统检测扩增结果。条带单一清楚、长度大小符合的产物才能用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。点样前样品需要进行处理形成单链，经过5 V/cm的电压电泳过夜后，用银染显色，然后进行基因型分析。

1.6测序

挑选纯合基因型的PCR产物进行切胶回收，连接到PMD18-T载体上转化到大肠杆菌DH5α上，经过大量繁殖后，通过鉴定后提取质粒送公司进行测序分析。

1.7统计分析

测序所得序列通过DNAMAN软件进行比对获得不同基因型之间具体的序列差异。采用SPSS 13.0软件中单因素方差法分析不同基因型之间体质量和屠宰性能的差异。

2结果与分析

2.1SSCP检测结果

以黑羽番鸭基因组DNA为模板与所设计的6对引物分别进行PCR扩增，扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶检测，扩增片段与预期大小一致且特异性好，方可用于SSCP分析。

在SSCP结果分析中发现，只有引物GH16扩增的片段可以检测到多态，聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染结果见图1。由图1可知，在黑羽番鸭群体中共检测到3种基因型，纯合子定义为AA、BB，杂合子定义为AB。

2.2不同纯合基因型的克隆和测序

取AA、BB基因型多个PCR产物进行回收、克隆、测序。AA和BB基因型之间序列比较发现，存在4个单核苷酸变异，均位于第1内含子，分别为第1 251位点A-C突变、第 1 322 位点A-G突变、第1 378位点T-C突变、第1 440位点G-A突变（图2）。

2.3不同基因型（基因）频率在黑羽番鸭群体中的分布

在引物GH16检测到的不同基因型在黑羽番鸭群体中分布情况见表2。由表2可知，杂合子AB型基因型频率最高，为0.614 8；AA型次之，为0.229 6；BB型最低，为0.155 6。A等位基因频率比B等位基因频率高0.074 0。

表2引物GH16不同基因型及等位基因在黑羽番鸭群体中的分布

素材样本量

（羽）基因型频率等位基因频率AAABBBAB黑羽番鸭1350.229 6 0.614 8 0.155 6 0.537 0 0.463 0

2.4遗传特性分析

根据GH基因突变位点等位基因频率可推算出黑羽番鸭群体平均纯合度为0.502 7，杂合度为0.497 3，多态性信息含量为0.373 6（表3）。

2.5生产性能与多态位点的关联性分析

2.5.1GH16多态位点对体质量性能的影响由表4可知，BB型公鸭体质量在所有时间点均处于最高值，初生时BB型公鸭体质量显著性高于AA型；在4、6、8周龄时3种基因型间体质量无显著差异；在2、10、13周龄时，BB型体质量显著性高于AA、AB型，AA与AB型之间无显著差异。除0周龄外，其他各周龄母鸭均以BB型体质量处于最高值；母鸭各周龄不同基因型之间均无显著性差异。表4引物GH16不同基因型间体质量比较

2.5.2GH16多态位点对屠宰性能的影响由表5可知，BB型公鸭活质量、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量均显著高于AA型、AB型；胸肌质量、腿肌质量、肝质量在3种基因型间无显著差异；BB型腹脂质量、心质量显著高于AB型，AA型与BB型、AB型无显著差异；BB型腺肌胃质量显著高于AA型，AB型与AA型、BB型无显著差异。

10个屠宰质量指标在母鸭3种基因型之间均无显著差异。表5引物GH16不同基因型间屠宰性能质量比较

3讨论

目前已经开展了大量畜禽关于GH基因多态方面的研究，结果表明其存在大量的多态位点，以猪GH基因多态性研究成效最为显著。在猪GH基因5′端、编码阅读框和3′端序列中总计26个SNPs，18个在内含子上，6个在外显子2中，1个在外显子3中，1个在外显子4中，某些SNPs对猪生产性能有显著性影响[3-7]。牛GH基因多态性研究主要是分析其对产奶量、乳脂率、乳蛋白的影响程度[8-10]。在禽类上，鸡GH基因在禽类上研究较早[11-15]，鸭研究处于相对落后阶段，尚有许多工作需要开展。许盛海等在鸭中检测到了11个点突变，分别为5′调控区序列2个，外显子4序列中1个，内含子2序列中7个，内含子3序列中1个[16-17]。邹剑敏等在GH基因外显子上第3 01位点发现了C-T突变，分析了这个突变点对血浆中低密度脂蛋白（LDL-C）含量具有显著影响[18]。吉文林等在我国6 个地方鸭品种中检测到了GH基因1个C-T突变，位于外显子4中，分析了该突变在不同鸭群中的分布情况[19]；伍革民等应用PCR-SSCP技术分析了5个品种鸭GH基因潜在的点突变，检测序列覆盖了5′和3′调控区及部分外显子和内含子，共发现了5个多态位点[20]；李慧芳等发现GH基因第4外显子C3701T 的突变对高邮鸭最长连产天数和双黄率有显著相关[21]。

本试验设计了6对引物，其中引物GH16出现了多态位点，在第1内含子上发现了4个SNP，分别为G945A、T1039G、A1251C和A1322G，形成了3个基因型，分别为AA型、AB型、BB型。2个等位基因的频率较为接近，黑羽番鸭的纯合度为0.502 7，多态信息含量为0.373 6，说明黑羽番鸭该位点上群体呈现中等多态。在杂合度越大、PIC越高的群体中遗传变异的程度就越大，在选育过程中可进行选择的潜力越大；以此类推，在杂合度越小、PIC越低的群体中遗传变异的程度就越小，对群体进行选择的潜力就越小。黑羽番鸭处于中等水平，说明对GH基因该位点还有选择空间。公鸭13周龄BB型的体质量（同宰前活质量）、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量显著高于AA型和AB型，3种基因型的胸肌质量与腿肌质量差异不显著；在内脏器官组织中，BB型腹脂质量、心质量显著高于AB型；AA型、AB型、BB型 3种基因型间屠宰指标百分比无显著差异；母鸭所有指标在3种基因型间均无显著差异。畜禽的生产性能是由内在遗传因素和外在环境因素共同作用的结果，不同性别的鸭在其内在因素的影响下，可导致同一基因在性别之间所起作用效果存在差异，导致最终所起作用不同。

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