★ 杨赛琳 刘彩霞 舒艳 斯晓莉 丁俐文 傅华洲

(1.浙江中医药大学 浙江 杭州310053;2.杭州市第一人民医院 浙江杭州310006)

恶性腹水是多种癌症晚期的临床表现，与原发疾病密切相关，预后差，平均生存期约20周。临床治疗恶性腹水的方法颇多，如利尿、腹穿穿刺放液、全身或腹腔内化疗等，但均存在较大毒副作用，患者耐受性差。免疫治疗及分子靶向治疗成本较高，尚不适宜广泛应用于临床［1-6］。因此开发疗效显著、价格低廉的中药及中成药制剂有着广泛的市场需求和应用前景。人参二苓汤具有补气健脾、燥湿利水等功效，组成药物价格低廉、药源广泛，组方合理有效。前期的研究发现，人参二苓汤主要用于中医在恶性肿瘤方面的维持治疗，具有增效、减毒及改善患者生存质量等作用［7-9］。本研究利用H22荷瘤小鼠恶性腹水模型筛选出人参二苓汤的有效部位的最佳剂量，并进一步探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 药材 人参二苓汤药材由杭州市第一人民医院中药房提供;替加氟片由山东齐鲁制药有限公司生产。

1.2 主要试剂与仪器 试剂:石油醚(分析纯，杭州大方化学试剂厂)，氯仿(分析纯，衢州巨化试剂有限公司)，乙酸乙酯(分析纯，杭州大方化学试剂厂)，正丁醇(分析纯，杭州双林化工试剂厂)，二甲基亚砜(DMSO)(分析纯，杭州双林化工试剂厂)，超级新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，细胞培养基1640(美国GIBCOBRL公司)，Elisa试剂盒(上海美轩生物技术有限公司)。

仪器:UV8500可见-紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)，倒置荧光显微镜(OLYMPUS IX71)，二氧化碳细胞培养箱(Thermo Electron Corporation HEPA CLASS100)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，旋转蒸发仪(R-201上海申顺生物科技有限公司)，循环水式真空泵(SHZ-Ⅲ巩仪市英峪予华仪器厂)，电子精密天平(AR2130 Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA)等。

1.3 实验动物 ICR小鼠60只，雌雄各半，体重18～22g，SPF 级，合格证号(SCXK 浙)2008-0033，购于浙江中医药大学动物实验中心研究中心。

2 实验方法

2.1 H22荷瘤小鼠恶性腹水模型的建立 小鼠H22肝癌细胞株，离心弃上清。加入生理盐水将细胞浓度调至1.0×107/mL。取0.5mL细胞悬液接种于小鼠腹腔内。待小鼠出现腹水后(接种第7天)，断颈处死小鼠，无菌条件下抽取腹水，放入离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入生理盐水吹洗，再离心，共2次。再用生理盐水稀释肿瘤细胞悬液(1.0×106/mL)。取该悬液0.2mL/只，接种于适应性饲养3天后的60只小鼠腹腔，建立腹水瘤动物模型［10，11］。

2.2 分组及给药

2.2.1 分组 荷瘤小鼠造模24小时后，将动物按体重随机分为模型对照组，阳性(替加氟)对照组，人参二苓汤有效部位低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组各12只。

2.2.2 给药 人参二苓汤先用70%乙醇浸提，浸膏采用水混悬，将浸膏悬溶于水，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到人参二苓汤的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取五个部位，根据前期动物实验结果，人参二苓汤正丁醇层为其有效部位，将人参二苓汤有效部位制备成每mL含生药1.1g。按《中药药理实验方法学》附表“人和动物间接体表面积折算表”，分别计算出3组用药剂量，分别是 6.1g/kg，9.9g/kg，13.2g/kg，用生理盐水稀释成低、中、高剂量组所需浓度灌胃给药，最后每组均给药0.4mL/只。小鼠腹腔接种H22肝癌细胞株48小时后，人参二苓汤各剂量组开始灌胃给药0.4mL/只，阳性对照组给予替加氟 0.4mL/只(120mg/kg)，模型对照组给予生理盐水0.4mL/只。每日1次，连续给药14天。

2.3 相关指标检测 给药期间观察各组小鼠毛色、食欲、活动状况和精神状态等一般的生活状况。每天给药前定时称体重和测量腹围，以及称量各组每天消耗鼠粮的重量。

给药第14天后停止治疗，第15天观察各组小鼠的生活状态和体重，测腹围。第16天处死全部小鼠。在无菌条件下用注射器抽取腹水，转入﹣80℃冰箱保存，待指标检测。解剖死亡小鼠，观察腹腔内情况，计数腹膜瘤结节数量并称重，计算抑瘤率。取出的腹膜瘤体放入Eppendorf管，转入-80℃冰箱保存，待进行相关指标检测。

抑瘤率(%)=［(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重］×100%

2.4 Elisa检测腹水中 VEGF、MMP-2、MMP-9 的含量 把抽取的腹水离心取上清液，用Elisa试剂盒检测腹水中的VEGF、MMP-2和MMP-9的表达，酶标仪检测各自的吸光度值，最后算出VEGF、MMP-2、MMP-9的含量。

2.5 数据分析 SPSS 13.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差(±s)表示，计数资料以χ2检验，多组间比较采用方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD检验法，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有极显著统计学意义。

3 实验结果

3.1 小鼠生活状态观察及体重腹围变化情况 模型对照组小鼠在第5天体重、腹围开始增长，在8～9天开始迅速增长，晚期表现为进食量减少、消瘦，腹部隆起，活动受限，倦怠懒动，毛发易脱落，精神状态差;替加氟组和人参二苓汤有效部位高剂量组体重、腹围缓慢增长，进食稍减;人参二苓汤有效部位中剂量组后期体重和腹围较快增长;人参二苓汤有效部位低、中、高各剂量组小鼠精神状态好。各组小鼠治疗前后体重及腹围的变化情况见表1。治疗后替加氟组和人参二苓汤有效部位各剂量组小鼠体重、腹围均低于模型组，其中替加氟组和人参二苓汤有效部位高剂量组有显著性差异(P＜0.01)，人参二苓汤有效部位中剂量组有差异(P＜0.05)，而人参二苓汤有效部位低剂量组无显著性差异(P＞0.05)。

表1 各组小鼠治疗前后体重、腹围变化(±s，n=12)

表1 各组小鼠治疗前后体重、腹围变化(±s，n=12)

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

体重(g)腹围(cm)组别 剂量(g/kg)83替加氟组 0.12 20.29±1.86 38.99±3.56＊＊ 6.01±0.17 8.58±0.51＊＊低剂量组 6.10 20.21±1.75 41.97±5.02 6.03±0.18 10.31±0.97中剂量组 9.90 20.63±1.61 39.56±3.64* 6.11±0.21 9.39±0.72*高剂量组 13.20 20.55±1.89 37.83±4.67＊＊ 6.09±0.18 8.77±0.65治疗前 治疗后模型组 NS 20.31±1.59 43.62±2.63 6.08±0.19 10.89±0.治疗前 治疗后＊＊

表2 对H22荷瘤小鼠恶性腹水的肿瘤抑制率(±s，n=12)

表2 对H22荷瘤小鼠恶性腹水的肿瘤抑制率(±s，n=12)

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 剂量(g/kg)腹膜瘤结节数平均瘤重(g)抑瘤率(%)NS 140 1.07±0.13 /替加氟组 0.12 99＊＊ 0.52±0.27＊＊ 51.40低剂量组 6.10 136 0.91±0.17 14.95中剂量组 9.90 128* 0.83±0.23 22.42高剂量组 13.20 120* 0.69±0.21*模型组35.51

3.2 人参二苓汤有效部位对H22荷瘤小鼠恶性腹水的肿瘤抑制率 表2结果显示:与模型组比较，替加氟组小鼠腹膜瘤结节数明显减少，有显著性差异(P＜0.01);人参二苓汤有效部位中、高剂量组小鼠腹膜瘤结节数减少，存在差异(P＜0.05);而人参二苓汤有效部位低剂量组小鼠腹膜瘤结节数无明显变化(P＞0.05)，因此人参二苓汤有效部位高剂量组和替加氟组对H22荷瘤小鼠恶性腹水的生长均有一定的抑制作用。

3.3 H22荷瘤小鼠恶性腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9的含量 由表3可知，与模型组比较，人参二苓汤有效部位高剂量组小鼠腹水中VEGF的含量有显著性差异(P＜0.01)，MMP-2和MMP-9的含量有差异(P＜0.05);人参二苓汤有效部位中剂量组小鼠腹水中VEGF的含量有差异(P＜0.05)，MMP-2和MMP-9的含量无差异(P＞0.05);人参二苓汤有效部位低剂量组小鼠腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9的含量均无差异(P＞0.05)。这说明人参二苓汤有效部位可抑制小鼠腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9的表达。

表3 小鼠腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9含量比较(±s，n=12)

表3 小鼠腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9含量比较(±s，n=12)

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 剂量(g/kg)VEGF(ng/mL)MMP-2(ng/mL)MMP-9(ng/mL)NS 1389.1±53.20 36.25±4.58 1.67±0.43替加氟组 0.12 987.2±36.28＊＊ 19.26±3.23＊＊ 0.52±0.17＊＊低剂量组 6.10 1293.2±37.85 30.19±4.17 1.31±0.19中剂量组 9.90 1051.5±55.23* 27.83±3.25 1.03±0.33高剂量组 13.20 1005.3±36.78＊＊ 21.69±2.24* 0.89±0.28模型组*

4 讨论

人参二苓汤由人参、茯苓、猪苓、白术、防风、蝉蜕组成。本方中君药为人参，具有大补元气，健脾养胃之功。用于本实验研究符合恶性肿瘤腹水患者久病体虚、正气不足的病机特点，正气充则邪不可干，脾胃健则湿邪自去。臣药有茯苓、猪苓，能够渗泄水湿，其中茯苓又能健脾益气，辅助人参增强健脾益气之功效。佐药用白术、泽泻，协助人参、茯苓增强温中健脾之效，同时加强二苓利水祛邪之功。方中蝉蜕有疏散风热、宣散透发之功效，蝉蜕亦有利水之功效，能防止方中参、术之温性太过，反致化热助邪。此方用药法度严明，紧扣恶性腹水患者脾虚湿盛的病机，故能随证取效。目前对人参二苓汤所涉单药在治疗肿瘤中的作用研究较多。如:现代医学认为人参皂苷和人参多糖不仅能增强机体免疫能力，而且可诱导肿瘤细胞凋亡;现代医学认为茯苓富含茯苓多糖，猪苓富含麦角甾醇多糖，可促进免疫抗肿瘤，其中羧甲基茯苓多糖可下调bcl-2基因(B细胞淋巴瘤中鉴定出来的癌基因)的mRNA和蛋白的表达来诱导癌细胞凋亡［10］。

目前研究认为，恶性腹水形成的机制之一是肿瘤侵袭腹膜和肠壁，使血管内皮细胞受损，增加血管通透性，血液中大分子物质渗出［4］。血管的发生过程对于肿瘤的生长和转移起着重要作用，而VEGF是肿瘤中血管生成的关键刺激因子。由于肿瘤组织内、外都可以大量分泌VEGF，可以通过对VEGF的阻滞，减少恶性腹水的形成，因此对VEGF活性的抑制是治疗恶性腹水的重要靶点之一。Xu等［11］研究表明，口服VEGF受体抑制剂PTK787 50mg/kg可抑制VEGF活性，降低血管通透性，进而抑制恶性腹水的形成。MMPs是一组锌离子依赖的蛋白水解酶家族，参与细胞外基质蛋白降解。研究表明，MMP-2和MMP-9属于MMPs家族成员中降解基底膜及细胞外基质的重要蛋白酶，在肿瘤浸润和转移中起重要作用，能促进血管生成，提高血管通透性，与恶性腹水的发生密切相关［12，13］。

本研究利用H22荷瘤小鼠恶性腹水模型，探讨人参二苓汤有效部位灌胃给药对恶性腹水的疗效。采用人参二苓汤有效部位低、中、高剂量组，连续灌胃给药14天，结果显示，人参二苓汤有效部位对H22荷瘤小鼠恶性腹水形成有显著的抑制作用，并且能提高生活质量。本研究还表明，人参二苓汤有效部位灌胃给药可降低H22荷瘤小鼠恶性腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9的含量，为临床使用中医药治疗恶性腹水提供了实验依据。

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