葛根提取工艺优选研究*

2014-11-07马冰洁钟凌云

江西中医药大学学报 2014年4期

★ 马冰洁钟凌云＊

(江西中医药大学药学院江西南昌330004)

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(wilId.)Ohwi的干燥根，葛根主要含有黄酮类化合物、三萜类和甾体类化合物等多种活性成分［1，2］，有文献报道［3-6］，葛根提取方法多样。笔者结合实际，选取了醇提回流法、水提回流法、索氏提取法、超声提取法四种方法提取，以葛根干浸膏得率、总黄酮得率、葛根素含量为考察指标进行单因素考察，再进行正交试验并采用综合评分法对葛根提取工艺进行优化。

1 材料

1.1 仪器高效液相色谱仪(Dionex UltiMate 3000);HyPersil BDS C18色谱(4.6mm ×200mm，5μm);PDA-3000二极管阵列紫外检测器;Chromeleon工作站;KQ3200超声波清洗器(杭州中拓仪器有限公司);METFLER AE240型十万分之一电子天平(瑞士METTLER);Sartorius万分之一电子天平(德国赛多利斯);KQ3200超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);FW100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);HH-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试药葛根购于江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，经本校葛菲教授鉴定为豆科葛属落叶藤本植物野葛Pueraria lobat(wilId.)Ohwi的干燥根。葛根素对照品(批号:10171-201303，南昌贝塔生物科技有限公司);甲醇为色谱纯;水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 提取方法考察研究

2.1.1 样品溶液制备水提回流法:20g葛根粉末，加入6倍量的水，提取两次，每次1.5h，合并滤液，减压浓缩并定容到100mL。

醇提回流法:20g葛根粉末，加入6倍量的90%的乙醇，提取两次，每次1.5h，合并滤液，减压浓缩并定容到100mL。

索氏提取法:20g葛根粉末，加入6倍量的90%的乙醇，提取 3h，合并滤液，回收乙醇，定容到100mL。

超声提取法:20g葛根粉末，加入6倍量的90%的乙醇，提取两次，每次30min，合并滤液，减压浓缩并定容到100mL。

2.1.2 葛根干浸膏含量测定吸取2.1.1项下样液50mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3h，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，得出浸出物含量，结果见表3。

2.1.3 葛根总黄酮含量测定方法

2.1.3.1 标准曲线的制备精密称取葛根素对照品0.0168g，加甲醇溶解于2mL容量瓶定容，分别吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL 定容至 1mL，配制成5个不同浓度的对照品溶液，于250nm处测定吸光度［7-9］。制备回归方程为 Y=1.3716X+0.1686，r=0.9999。可见葛根素总黄酮浓度在0.84～4.2 mg/mL之间线性关系良好。

2.1.3.2 精密度实验对浓度为0.84 mg/mL的同一标准品溶液平行测定5次，RSD为0.94%，精密度良好。

2.1.3.3 稳定性考察取浓度为0.84 mg/mL的同一样品溶液分别在0，6，12，18，24 h测定吸收度，RSD为0.84%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.1.3.4 重现性实验精密称取浓度为2.52 mg/mL的同一样品，平行操作5次，RSD为1.14%，结果具有良好的重现性。

2.1.3.5 加样回收率试验精密称取已知含量的样品1 mL，精密添加一定量的葛根素对照品，依法测定，结果平均回收率为99.53%，RSD为1.33%，见表1。

表1 葛根总黄酮回收率试验

2.1.3.6 样品的测定精密吸取2.1.1项下样液20mL，水浴蒸干，残渣加甲醇超声溶解成50mL供试液，于250nm处测定吸光度［7-9］，结果见表3。

2.1.4 葛根素含量测定

2.1.4.1 色谱条件色谱柱Diamonsil C18(4.6 mm×250mm，5 μm);流动相甲醇∶水(25∶75)，检测波长250 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min。

2.1.4.2 标准曲线的制备精密称取葛根素对照品0.0049g，置2 mL容量瓶中，加30%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，配成2.45mg/mL的溶液，分别吸取0.01，0.02，0.2，0.4，0.8mL 于 1mL 容量瓶中，30%乙醇溶液至刻度。精密吸取10μL上述对照品溶液注入液相色谱仪，按色谱条件进行测定，得出回归方程为 Y=619.24X+4.446(r=1)，其线性关系良好。

2.1.4.3 精密度试验精密吸取浓度为0.49mg/mL的同一对照品溶液10 μL，按照上述色谱条件连续测定5次，记录峰面积，RSD为0.04%。

2.1.4.4 稳定性试验吸取浓度为0.49mg/mL的同一对照品溶液，在相同的色谱条件下，在0，6，12，18，24 h 分别进样 10 μL，记录峰面积，RSD 为0.14%。

2.1.4.5 重复性试验精密吸取浓度为0.49mg/mL的同一对照品溶液5份平行测定5次，每次进样品 10 μL，RSD 为 0.93%。

2.1.4.6 加样回收率试验吸取已知含量的5个样品1 mL，精密添加一定量的葛根素对照品，依法测定，结果平均回收率为100.12%，RSD为0.30%，见表2。

表2 葛根素回收率试验

2.1.4.7 样品的测定精密吸取2.1.1项下样液1mL，加30%乙醇定容至100mL，用0.45μm微孔滤膜滤过作为供试液，测定峰面积，得出葛根素含量，结果见表3。

2.1.5 评价方法采用多指标试验综合评分法处理数据:将干浸膏得率、总黄酮含量及葛根素含量最大值均设为100分，其余各样品所得结果依次换算成相应的分数。干浸膏占30%，葛根素含量及总黄酮含量各占35%，将三者加权求得综合评分。

2.1.6 结果

表3 四种提取方法实验结果

由表3可知:水提回流法综合得分最高，综合实验结果并结合实际生产需要，选用水提回流法进行正交设计优选葛根提取工艺。

2.2 正交试验优选葛根最佳提取工艺

2.2.1 正交设计因素水平表见表4。

表4 提取因素水平表

表5 L16(45)正交试验安排、结果及分析表(n=4)

2.2.2 样品溶液制备精密称取葛根粉末20g，加水倍数、提出次数及提取时间按表5进行实验，合并滤液，减压浓缩并定容至100mL。

2.2.3 葛根干浸膏含量测定测定方法同“2.1.2”项下，结果见表5。

2.2.4 葛根总黄酮含量测定测定方法同“2.1.3.6”项下，结果见表5。

2.2.5 葛根素含量测定测定方法同“2.1.4.7”项下，结果见表5。

2.2.6 评价方法及结果采用多指标试验综合评分法处理数据:将干浸膏得率、总黄酮含量及葛根素含量最大值均设记做为100分，其余各样品所得结果依次换算成相应的分数。将三者加权求得综合评分，浸膏占30%，葛根素含量及总黄酮含量各占35%，以此为基础进行正交试验数据处理和方差分析，结果见表6。

表6 Tests of Between-Subjects Effects

由正交试验结果及表6可得，因素 A:F=4.803，P=0.049＜0.05，具有统计学意义。B和C因素的P均大于0.05，均不具有统计学意义。由a表的A在第三水平时平均值较大，取A3。根据b和c表，可得因素B在取B2时平均值较大。因素C在取C3时平均值较大，考虑实际生产需要，C取C2。所以最佳组合应为A3B2C2。即加8倍量的水，提取2次，每次1.5h。

通过正交试验得葛根药材的最佳提取工艺为:以水为溶剂，煎煮是加入8倍量的水，提取2次，每次1.5h。有效成分提取率较高，生产成本降低，此法较为适于葛根的实际生产。