刘登全，崔朝宇，蒋军喜*，龙 珑

(1.江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045;2.江西省丰城市农业局，江西 丰城 331100)

柑橘黄龙病(citrus huanglongbing，HLB)，也称柑橘青果病(greening)，是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害［1］。自1919年Reinking首次报道我国华南地区发生柑橘黄龙病以来，已有亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲在内的40多个国家报道黄龙病的发生［2-3］。黄龙病的病原为原核生物界α-变形杆菌纲(α-prteobacterim)韧皮部杆菌属(Liberibacter)细菌，共有3种韧皮部杆菌属细菌与黄龙病有关，即亚洲种(Candidatus liberibacter asiaticus，CLas)、非洲种(Candidatus liberibacter africanus，CLaf)和美洲种(Canditatus liberibacter americanus，CLam)［4-7］。CLas分布于我国及其他许多产橘国，CLaf和 Clam 则各限于非洲和巴西。柑橘黄龙病菌仅限于韧皮部内寄生，难以人工培养［8］，主要依靠柑橘木虱(Diaphorina citri)或非洲木虱(Trioza eryetreae)传播，并能通过嫁接和菟丝子传播［9］。对黄龙病的防治，目前主要依靠挖除病树、控制介体柑橘木虱的发生和使用无病苗木等措施［10］。

长期以来，人们对黄龙病进行了大量研究，特别是在2004年和2005年黄龙病分别被传入巴西和美国之后，对黄龙病的研究更趋活跃，研究程度也明显加深［11］，其中，最能反映该病研究水平的是有关柑橘与黄龙病菌互作的分子机理研究，其研究结果对于从分子水平上解析黄龙病的发生本质产生了重要作用［12-13］。然而，若从解析黄龙病的抗性机理而言，上述研究结果尚存在一定的局限性，主要原因是在目前的柑橘与黄龙病菌互作体系中，对寄主柑橘的抗性水平还不是很了解。通过明确柑橘对黄龙病的抗性水平，开展其特定的亲和性和非亲和性互作的分子机理研究，将有望实现解析黄龙病抗性分子机理、进而挖掘抗性基因和对柑橘品种进行抗性改良的目标。本文拟在前人研究的基础上，选择椪柑、琯溪蜜柚、晚熟温州蜜柑3个品种，在严格控制条件下，就其对柑橘黄龙病的抗性进行室内鉴定，以期筛选出高感和高抗黄龙病的品种，为开展柑橘黄龙病亲和性互作和非亲和性互作的分子机理研究奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 供试柑橘品种

供试柑橘品种为椪柑(Citrus reticulata Blanco cv.ponkan)、琯溪蜜柚(Citrus grandis(L.)Osbeck cv.guanximiyou)和晚熟温州蜜柑(Citrus unshiu Marc.)，均为2年生无病苗木，由江西双金园艺场柑橘试验站提供，苗木运回后盆栽，置于25℃、12L∶12D光暗交替的人工气候室中培养，常规管理，盆栽2个月后供嫁接试验。

1.2 柑橘黄龙病毒源树获得

本研究通过实地调查，在江西省大余县池江镇曾家果园发现了数株疑似柑橘黄龙病的病树，从中选取2株病树(脐橙1号，脐橙2号)，取其叶片带回室内进行黄龙病菌、柑橘衰退病毒和柑橘植原体的PCR检测，以期获得只含有黄龙病菌，而不含衰退病毒和植原体的柑橘黄龙病菌单一毒源。

1.2.1 对毒源树进行柑橘黄龙病菌检测 用植物基因组DNA提取试剂盒提取2份疑似病样的总DNA，以此DNA为模板，用黄龙病菌特异性引物A2/J5［14］(A2:5'-TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3';J5:5'-AC AAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3')对样品进行PCR扩增，阴、阳性对照分别为健康柑橘植株和已知柑橘黄龙病叶片。PCR反应体系25 μL:包括4 μL DNA模板，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各1 μL(10 μmol/L)，6.5 μL去离子水，混匀后进行PCR扩增。反应条件为94℃预变性4 min;94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环;72℃补平10 min。PCR结束后进行10 g/L的琼脂糖凝胶电泳。

1.2.2 对毒源树进行柑橘植原体检测 以上述总DNA为模板，采用PCR方法检测2个样品中是否含有柑橘植原体，其特异性引物为植原体通用引物 R16mF2/R16mR1［15］(R16mF2:5'-CATGCAAGTCGAACGGA-3';R16mR1:5'-CTTAACCCCAATCATCGAC-3')，阴性对照为健康柑橘植株，阳性对照质粒由华南农业大学邓晓玲教授惠赠。PCR反应体系25 μL:包括2 μL DNA模板，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各 0.5 μL(10 μmol/L)，9.5 μL 去离子水，混匀后进行 PCR 扩增。反应条件为95℃预变性5 min;95℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环;72℃补平10 min。PCR结束后进行10 g/L的琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3 对毒源树进行柑橘衰退病毒检测 衰退病毒检测引物为rP672/fP672(rP672:5'-ATG-GACGACGARACAAAG-3';fP672:5'-TCAACGTGTGTTRAATTTCC-3';R=A/G)，参照周彦［16］及 Gen-Bank中基因序列自行设计。先用植物总RNA快速抽提试剂盒对以上2个样品进行总RNA的提取。使用Promega反转录试剂盒对提取的总RNA进行反转录。反转录体系20 μL:MgCl24 μL，10×反转录缓冲液 2 μL，dNTP 混合物 2 μL，RNasin@抑制剂 0.5 μL，AMV 反转录酶 1 μL，fP672(下游引物)1 μL，模板RNA 3 μL，去离子水6.5 μL，充分混合后42℃水浴30 min合成cDNA第一链。以此cDNA第一链为模板立即进行 PCR 反应。PCR 反应体系25 μL:模板4 μL，引物各0.5 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，去离子水7.5 μL;充分混合，反应条件为:94℃预变性4 min;94℃变性35 s，58℃退火35 s，72℃延伸70 s，35个循环;72℃补平10 min。柑橘衰退病病叶阳性对照由赣南师范学院易龙教授提供。PCR结束后进行10 g/L的琼脂糖凝胶电泳。

1.3 用柑橘黄龙病毒源嫁接各柑橘品种

用取自脐橙1号病树芽作为接穗，嫁接到各供试柑橘品种上，每个品种嫁接3株(3次重复)，并设健康苗木作对照。试验苗木置于人工气候室内生长。待嫁接芽长出后逐日观察各供试植株的显症情况，详细记载各植株在嫁接后3、4、6、8个月后的症状表现并作相应的黄龙病菌PCR检测。

2 结果与分析

2.1 柑橘黄龙病毒源树获得

2.1.1 毒源树的柑橘黄龙病菌检测 采用黄龙病菌特异性引物A2/J5，对2株可疑病株叶片DNA进行PCR扩增，结果从中均扩增出一条大小约为700 bp的特异性条带，符合预期大小(图1)，可见两株病树均含有黄龙病菌。

2.1.2 毒源树的柑橘植原体检测 使用柑橘植原体特异性引物R16mF2/R16mR1，对上述2株可疑病株叶片DNA进行PCR扩增，结果从中均未扩增到特异性条带(图2)，可见两株病株均不含有柑橘植原体。

图1 毒源树柑橘黄龙病菌PCR检测电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR product from Candidatus Liberibacter asisticus in HLB-infected citrus tree

图2 毒源树柑橘植原体PCR检测电泳图Fig.2 Electrophoresis of PCR product from phytoplasma in HLB-infected citrus tree

2.1.3 毒源树的柑橘衰退病毒检测 通过对上述两株可疑病株叶片提取RNA，进行反转录合成cDNA，然后采用特异引物rP672/fP672进行PCR扩增，结果均未扩增到特异性条带(图3)，可见两株病树均不含有柑橘衰退病毒。

2.2 用柑橘黄龙病毒源嫁接各柑橘品种

不同柑橘品种嫁接黄龙病菌毒源后，其症状表现和体内带菌情况见图4。椪柑:嫁接3个月后，新长出的叶片开始显示出斑驳黄化症状，经过病原菌PCR检测能够检测到黄龙病菌的存在;嫁接4个月后，整株叶片均表现出明显的黄化症状，叶片细小，有落叶现象;嫁接6个月后，落叶现象明显且有的叶片颜色变为黑褐色，植株上叶片数量稀少，很少见到有新叶长出;嫁接8个月后，树叶全部脱落直至死亡。

琯溪蜜柚:嫁接3个月后，颜色没有任何变化，仍保持正常绿色，经病原检测没有检测到黄龙病菌的存在;嫁接4个月后，仅仅是幼叶叶尖颜色略显褪绿，对新叶进行病原检测能够检测到黄龙病菌的存在;嫁接6个月后，叶片略显斑驳症状;嫁接8个月后，叶片仍略显斑驳症状，植株依然能够抽梢生长。

晚熟温州蜜柑从嫁接开始至8个月后依然没有检测到黄龙病菌的存在，叶片颜色没有任何明显的变化，和健康的对照组均为正常的绿色。

图3 毒源树柑橘衰退病毒PCR检测电泳图Fig.3 Electrophoresis of PCR product from Citrus tristeza virus in HLB-infected citrus tree

图4 不同柑橘品种接种黄龙病菌后的症状表现Fig.4 Symptom appearance of different citrus cultivars after inoculating CLas

3 讨论

在柑橘黄龙病抗性鉴定及其他相关研究中，目前使用最多的接种方法是嫁接法［17］，即将带有黄龙病菌的毒源树枝条或芽嫁接到供试的健康柑橘品种上，定期观察受体植株的症状表现。在此鉴定过程中，毒源树的准备至关重要。本文在根据田间症状初步选定柑橘黄龙病毒源树的基础上，对该树进行了黄龙病菌的PCR检测，结果表明该树确实携带黄龙病菌。鉴于柑橘植原体和柑橘衰退病毒导致的症状与黄龙病菌导致的症状大同小异［18］，因此，为了排除毒源树中只含有黄龙病菌，而不含有植原体和衰退病毒，笔者对该毒源树进一步做了植原体和衰退病毒的检测，结果均排除了毒源树中植原体和衰退病毒的存在。可以看出，本文的毒源纯一，以此毒源进行的黄龙病品种抗性鉴定结果可信可靠。

本文选择的椪柑、琯溪蜜柚和晚熟温州蜜柑3个柑橘品种是根据他人的研究结果挑选的。椪柑被普遍认为属于黄龙病的高感品种，在品种抗性嫁接试验和病原检测实验中也反映出其高感黄龙病的特性［19］。本研究则在保证毒源纯一和发病条件一致的前提下，结合采用嫁接和PCR检测技术，开展不同柑橘品种对黄龙病抗性的比较研究，结果进一步表明了椪柑属于高感黄龙病品种。因此，椪柑无疑可以作为高感品种开展柑橘与黄龙病菌的亲和性互作研究。琯溪蜜柚和晚熟温州蜜柑在本实验中对柑橘黄龙病菌表现较强的抗性，特别是晚熟温州蜜柑的抗性表现更强，然而，这两个品种在有些报道中却表现为耐病［19-20］。为此，本项目组还将对这两个品种做进一步的抗性鉴定试验，以使筛选到的高抗品种更具说服力。

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