姚譞，何枢衡，唐英

(1.国家中药制药工程技术研究中心，上海 201203；2.上海中药制药技术有限公司，上海 201203)

金钱草抗痛风活性组分的提取分离及药效筛选△

姚譞1，2*，何枢衡1，2，唐英1，2

(1.国家中药制药工程技术研究中心，上海 201203；2.上海中药制药技术有限公司，上海 201203)

目的：以药效指标及化学成分含量为导向，考察金钱草提取纯化工艺路线，筛选金钱草抗痛风活性组分，并对活性组分开展药效学研究和化学成分分析。方法：建立高尿酸血症小鼠模型，对金钱草的不同提取和纯化组分进行药效筛选，以UV法测定各组分总黄酮含量，两者相结合优选金钱草提取纯化工艺路线。从降尿酸活性和抗炎活性方面对活性组分开展药效学研究，考察量效关系，并采用HPLC分析方法对其主要化学成分进行研究。结果：最佳提取分离工艺为金钱草通过乙醇提取，以Diaion HP-20大孔树脂为柱填料，用30%乙醇洗脱除杂，收集60%乙醇洗脱所得组分(LCA60)。经药效学研究LCA60可显著降低高尿酸血症小鼠模型血清尿酸含量，且具有明显的抗炎活性，经UV和HPLC分析，其总黄酮含量为67.0%，其中包括有山柰酚8.4%、槲皮素7.6%、芦丁7.3%、表儿茶素9.1%、橙皮苷8.8%。结论：LCA60为筛选得到的金钱草抗痛风活性组分。

金钱草；活性组分；痛风；总黄酮

痛风是长期嘌呤代谢障碍、血尿酸增高引起组织损伤的一组异质性疾病，临床特点为高尿酸血症、急性痛风性关节炎反复发作、痛风石沉积、特征性慢性关节炎和关节畸形，常累及肾脏，引起慢性间质性肾炎和肾尿酸结石形成[1]。临床常用非甾体抗炎药和秋水仙碱治疗急性痛风性关节炎，别嘌醇片降低血中尿酸浓度，丙璜舒和苯溴马隆作为尿酸排泄剂，但这些药物具有明显的副作用，不适合长期使用[2]。目前，从中草药中寻找新型抗痛风药物成为热点，民间及中医临床上常用金钱草单味或复方治疗高尿酸血症、痛风，无明显不良反应[3]。笔者以高尿酸血症小鼠模型的药效指标及主要活性组分含量为指导，开展提取分离金钱草中抗痛风活性组分研究，为开发抗痛风植物药提供参考。

1 材料

1.1 动物

昆明种小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，雄性，体重(28±2)g。使用前在实验室饲养7 d以适应环境，在整个实验过程中自由饮水和供给食物。

1.2 试药

金钱草(上海华宇药业有限公司)；氧嗪酸钾、别嘌呤醇(Sigma公司)；阿司匹林片(丹东医创药业有限责任公司)；山柰酚对照品(批号：110861-200606)、槲皮素对照品(批号：100081-200406)、芦丁对照品(批号：100080-200707)、表儿茶素对照品(批号：110878-200102)、橙皮苷对照品(批号：110721-200512)(中国食品药品检定研究院)；尿酸(URIC)试剂盒(Beckman公司)；Diaion HP-20大孔吸附树脂(北京绿百草科技发展有限公司)。

1.3 仪器

BECKMAN COULTER AU480全自动生化分析仪；Agilent 1260高效液相色谱仪。

2 方法

2.1 金钱草的提取分离

金钱草水提物(LCWE)：按照水提工艺制备，提取2次，每次提取1 h，第1次12倍水，第2次10倍水，过滤，合并两次提取液，减压、浓缩干燥至固体。

金钱草醇提物(LCAE)：按照醇提取工艺制备，提取2次，每次10倍70%乙醇加热至60 ℃，回流提取1 h，过滤，合并两次提取液，减压、浓缩干燥至固体。

金钱草醇提物分离纯化：取制备的金钱草醇提物，加水溶解，经树脂选型及筛选，选择Diaion HP-20大孔吸附树脂进行层析，提取物树脂质量比为1∶20。依次用水及30%，60%，95%乙醇水溶液进行洗脱，每个梯度洗脱4～5个柱体积，每小时流速为2～3个柱体积。洗脱结束后30%乙醇部位(LCA30)、60%乙醇部位(LCA60)和95%乙醇部位(LCA95)分别浓缩干燥。

2.2 高尿酸血症小鼠模型

昆明种小鼠按体重随机平均分组，每组12只，设立空白对照组、高尿酸血症模型组、别嘌呤醇阳性药物组、金钱草各实验组。阳性药物组灌胃给予别嘌呤醇，剂量为2.5 mg·kg-1，金钱草各实验组灌胃给予各样品，其余各组给予蒸馏水，连续给药7 d。末次给药前0.5 h腹腔注射氧嗪酸钾，剂量为300 mg·kg-1，空白对照组腹腔注射0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，1.5 h后摘眼球采血，血样采集后于室温放置约1 h，待血液完全凝固后于3 500 r·min-1、4 ℃条件下离心10 min，取血清用生化分析仪检测血清尿酸含量。

2.3 小鼠耳肿胀炎症模型

用二甲苯致小鼠耳肿胀，建立小鼠耳肿胀炎症模型。小鼠随机分为金钱草各实验组、空白对照组和阿司匹林阳性药物组，每组12只。灌胃容积均为20 mL·kg-1，连续给药7 d，末次给药后1 h，小鼠右耳均匀涂上25 μL二甲苯致炎，15 min后处死小鼠，剪下左、右两耳，用直径8 mm打孔器在同一部位冲下耳片，称重，以左、右耳片重量差值表示炎性肿胀程度，肿胀度(g)=右耳片重量-左耳片重量，将其耳肿胀度进行组间比较，进行t检验。

2.4 活性组分含量分析方法

2.4.1 总黄酮含量测定 以芦丁为对照品，通过UV测定活性组分中的总黄酮类成分。分别吸取芦丁对照品储备液(0.2 mg·kg-1)0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于6个25 mL容量瓶中，分别加入蒸馏水7.0，6.0，5.0，4.0，3.0，2.0 mL，摇匀；加入5%亚硝酸钠1.0 mL，摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min；再加4%氢氧化钠溶液10 mL，加蒸馏水至定容，摇匀，显色15 min后，于510 nm波长测其吸光度。用最小二乘法线性回归，溶液吸光度(Y)与芦丁质量浓度(X)(mg·mL-1)的回归方程为Y=5.175 8X+0.003 2，r=0.999 6。

按照上述方法测定待测溶液中总黄酮吸光度，由回归方程即可求得总黄酮含量。

2.4.2 活性组分中的化学成分组成测定 应用HPLC，色谱条件：Agilent 1260 DAD，色谱柱为AX-09柱；流动相为乙腈-2%冰醋酸梯度洗脱；检测波长为274 nm；柱温为30 ℃。精密称量LCA60样品26.1 mg置于25 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解后定容至刻度，过滤，即得。精密吸取样品溶液5 μL，注入液相色谱仪，按色谱条件分析。流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

3 结果

3.1 金钱草提取工艺筛选

金钱草在传统使用以及中药复方临床上均采用水煎的方式服用[4-5]，而分析表明其化学成分主要是黄酮苷以及黄酮类成分，如芦丁、槲皮素等非水溶性成分[6-8]，为提高金钱草提取工艺的科学性，以药效指标和有效成分含量为导向，对金钱草水提和醇提取两种提取工艺路线进行筛选和比较。

根据水提和醇提工艺，分别制备得到LCWE和LCAE，建立氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠模型[9]，比较研究2种提取物的降尿酸药效作用，平行设空白对照组、模型组和阳性药物组。表2结果表明，小鼠在腹腔注射氧嗪酸钾后，与空白对照组相比，血清尿酸水平显著提高，差异有统计学意义，表明建模成功。LCAE相比于LCWE具有更好的降尿酸药效，与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。含量测定结果表明，LCAE出膏率为8.3%，总黄酮以芦丁计质量分数为24.7%，相比LCWE含量更高，出膏率更低。因此，基于药效指标和化学成分含量综合考虑，金钱草醇提取相比于水提取，能够更好地提取和富集其总黄酮部位，具有较低的出膏率，避免提取更多的杂质成分，且药效作用更优，醇提取工艺为更优的金钱草提取方法。

表2 金钱草水提物和醇提物出膏率、总黄酮含量及血清尿酸比较

注：与模型组比，**P<0.01；与空白对照组相比，△△P<0.01

3.2 金钱草抗痛风中药组分的分离纯化和筛选

大孔吸附树脂是中药提取液精制、去除无效成分的一种分离纯化工艺。前期考察了多个大孔吸附树脂对金钱草醇提物的分离纯化效果，筛选得到Diaion HP-20型号大孔吸附树脂进行样品制备，综合考虑药效指标和总黄酮含量，筛选经过大孔吸附树脂分离的不同部位，以得到具有最优疗效的中药组分。

对LCAE进行进一步分离，得到3个分离部位(LCA30、LCA60和LCA95)。通过高尿酸血症小鼠模型，筛选各部位的降尿酸药效作用，表3结果表明，LCA30和LCA60相比于粗提物LCAE具有更优的降尿酸药效，说明其活性成分在这2个分离部位得到富集，其中LCA60具有最优效果；与模型组相比，血清尿酸含量差异具有统计学意义(P<0.01)，而LCA95活性较低。含量分析数据表明，LCA60中总黄酮含量最高，达到67.0%，相比初提物LCAE和其他分离部位有明显的优势。

表3 金钱草醇提物不同分离部位对高尿酸血症模型小鼠血清尿酸含量的影响

注：(1)n=12；(2)与模型组比，*P<0.05，**P<0.01

3.3 中药组分LCA60的药效学研究

对筛选得到的中药组分LCA60从降尿酸活性和抗炎活性两个方面开展药效学验证实验，LCA60分别以质量分数为0.2，0.4，0.8 g·kg-1的低、中、高剂量组进行给药，给药周期为7 d。分别选择别嘌呤醇和阿司匹林作为降尿酸和抗炎的阳性药物的对照组。表4结果表明，对小鼠耳肿胀的抑制实验中，3个剂量组均对二甲苯所致小鼠耳肿胀有一定的抑制作用，中、高剂量组与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。对高尿酸血症小鼠模型，3个剂量组亦有降低小鼠血清尿酸浓度作用，中、高剂量组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。药效结果表明，高、中、低3个剂量组的LCA60表现出良好的量效关系，组分LCA60具有明确的降低血清尿酸含量和抗炎药效作用，是从金钱草中提取分离得到的抗痛风活性组分。

表4 金钱草活性组分LCA60的药效学结果

注：与空白对照组比较，△△P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.4 金钱草抗痛风活性组分LCA60的化学成分组成研究

按2.4方法对活性组分LCA60进行测定，筛选研究结果表明，各受试物的药效作用和总黄酮含量呈正相关，说明金钱草黄酮类化合物可能是其活性物质。进一步分析活性部位LCA60的化学成分组成，HPLC分析结果表明，金钱草抗痛风组分LCA60中总黄酮含量为67.0%，其中包括有山柰酚8.4%、槲皮素7.6%、芦丁7.3%、表儿茶素9.1%、橙皮苷8.8%。见表5、图1。

表5 LCA60化学成分组成

图1 金钱草活性组分LCA60 HPLC图

4 讨论

随着人民生活水平的提高、饮食结构的变化，我国痛风的发病率呈逐年上升趋势。痛风是一种代谢性疾病，难以根治，有较高的危害性，加强对痛风防治药物的研究尤为重要。笔者通过考察金钱草提取和分离工艺，结合药效筛选和含量测定，得到中药组分LCA60。药效学研究结果表明，LCA60具有明显的降低血清尿酸水平和抗炎药效作用，其低、中、高剂量组均具有一定疗效，具有良好的量效关系。有研究表明黄酮类化合物具有黄嘌呤氧化酶抑制作用[10]，可能是LCA60降低血清尿酸水平的作用机制。区别于化学合成药物如别嘌呤醇，活性组分LCA60来源于临床常用中草药金钱草，具有较高的安全性。综上所述，金钱草中活性组分LCA60具有明确的抗痛风疗效，活性成分基本清晰，安全性良好，具有进一步开发成为抗痛风植物药的基础。

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ExtractionSeparationandPharmacodynamicScreeningofAnti-goutActiveComponentsfromLysinwchiachristinaeHance

YAO Xuan1，2*，HEShuheng1，2，TANGYing1，2

(1.NationalEngineeringResearchCenterforTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，China；2.ShanghaiTraditionalChineseMedicineTechnologyCo.，Ltd.，Shanghai201203，China)

Objective：Active ingredient content and pharmacodynamic effect were used to investigate the process route for extraction and purification，screen the anti-gout active components fromLysinwchiachristinae，and pharmacodynamic and chemical components analysis were also studied for active components.Methods：Hyperuricemia mice model was established for pharmacodynamic screening of different components of extraction and purification，and UV method was used to test content of total flavonoids of different components，which were combined to optimize the process route forL.christinae.Pharmacodynamic studies were developed to test thedose-effect relationship from uric acid reduction activity and anti-inflammatory activity of active components..The chemical composition were analyzedby HPLC methods.Results：The best extraction and separation technology for the herbs ofL.christinaewas by ethanol extraction，and separating the components by macroporous resin Diaion HP-20 with 30% ethanol washing to remove impurities.LCA60 was gained by collecting the component from 60% ethanol elution，which was selected to be the active components for decreasing the content of serum uric acidandanti-inflammatory significantly.The total flavonoids content of LCA60 was 67.0%，which contained 8.4% kaempferol，7.6% quercetin，7.3%rutin，9.1% epicatechin and 8.8% hesperidin.Conclusion：LCA60 was the active components for anti-gout，which provided theoretical foundation for the clinical application ofL.christinae.

LysinwchiachristinaeHance；Active components；Gout；Total flavonoids

2014-07-29)

上海市科学技术委员会中药现代化专项(11DZ1970800)

*

姚譞，工程师，研究方向：中药新药开发、中药药理；E-mail：yx@nercmtcm.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.005