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(暨南大学理工学院食品科学与工程系,广东广州 510632)

大蒜素的臭氧氧化合成以及在大蒜精油中的应用研究

李文清,周华*,晏日安,黄雪松,欧仕益

(暨南大学理工学院食品科学与工程系,广东广州 510632)

为了提高大蒜素的产率和大蒜精油中大蒜素的含量,本文以二烯丙基二硫醚为原料,以臭氧为氧化剂化学合成大蒜素,研究反应温度、反应时间、反应物浓度、臭氧流量对大蒜素产率的影响。结果表明：大蒜素产率随着反应时间的增加而不断上升,但在反应进行4h后,有副产物产生；大蒜素产率随着反应温度、二烯丙基二硫醚浓度、臭氧流量的增加呈现先上升后下降的趋势。采用响应面分析法,得到了大蒜素的最优合成条件：反应时间为4.0h,反应温度为8.06℃,臭氧通入量为0.28L/min,二烯丙基二硫醚浓度为0.18mmol/mL,大蒜素产率为59.53%。说明最优条件下,采用臭氧氧化大蒜精油,可以获得富含大蒜素的大蒜精油,大蒜精油的品质得到了提升和改善。

大蒜素,臭氧,氧化,大蒜精油

大蒜素(别名：二烯丙基硫代亚磺酸酯；英文名：Allicin)是大蒜中最具代表性的一种含硫化合物,就其风味而言,大蒜素比大蒜中其他含硫化合物更接近新鲜大蒜的味道[1],其生物活性特别是抗氧化活性更是远远强于大蒜中的其他化学成分[2-4]。目前制备大蒜素的方法主要有两种：一、从大蒜中直接提取,李瑜等报道用乙醇提取大蒜,可以得到大蒜素含量为75.03%的大蒜精油[5],但放置一段时间后,大蒜素因为分解而所剩无几[6]。必须说明的是,目前工业生产中使用的大蒜精油,基本都采用水蒸气提取法[7-8]。但是该方法得到的不是大蒜素,而是以二烯丙基二硫醚为主要成分的混合物。二、化学合成法,采用双氧水[9]或对氯过氧苯甲酸[10]为氧化剂,以二烯丙基二硫醚为反应原料,经化学合成得到。这两种方法各有利弊,直接提取法,优点在于纯天然,缺点是成本较高；第二种方法优点在于合成效率高,但是产品非天然。但无论采用上述哪种方法,大蒜素均不能保存太长的时间。为了提高大蒜素的产率和大蒜精油中大蒜素的含量,本文以二烯丙基二硫醚为模型化合物(其为水蒸气提取大蒜精油中的主要成分),采用臭氧(家庭一般具有消毒柜,里面包括臭氧发生器)氧化制备大蒜素,研究合成大蒜素的影响因素和最优工艺条件。并将此最优工艺条件应用于大蒜精油(由水蒸气常压蒸馏法提取得到)的臭氧氧化反应中,得到富含大蒜素的大蒜精油,从而提高其生物活性,保持新鲜大蒜的味道。该方法是提高大蒜精油品质的一种简单有效方法。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

二烯丙基二硫醚、L-半胱氨酸、DTNB、Tris-Base缓冲剂 购自阿拉丁试剂公司；氢氧化钠、冰乙酸 购自广州化学试剂厂；石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇、硅胶、浓盐酸、二氯甲烷 购自天津市大茂化学试剂厂；大蒜 购自于暨南大学兴安超市。

TU-1900型双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Acculab ALC210型电子分析天平 上海第二天平仪器厂；HJ-5多功能搅拌器 常州澳华仪器有限公司;101A-1 型电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂有限公司；WFH-203(ZF-I)型三用紫外分析仪 上海顾村电光仪器厂；臭氧发生器 上海实验仪器厂有限公司；pH检测仪 上海安亭科学仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1 大蒜素的臭氧氧化合成 称取一定质量的二烯丙基二硫醚,将其移至干净的三口烧瓶中,再加入5mL无水乙醇。将三口烧瓶置于水浴锅中,保持一定温度,打开臭氧发生器通入臭氧。反应开始后,用TLC法跟踪反应进程,待反应结束后使用柱层析分离纯化得到大蒜素。经核磁测定产物结构,其氢谱和碳谱数据为1HNMR(400MHz,CD3COOD):δ 3.72～3.92(m,4H),5.20～5.56(m,4H),5.88～5.99(m,2H)ppm;13CNMR(75MHz,CD3COOD):δ 35.02、59.90、119.10、124.00、125.80、132.90ppm。与文献报道一致[10]。

在5mL的容量瓶中的依次加入1.0mmol/L半胱氨酸溶液0.5mL,稀释后的大蒜素样品液0.5mL,在26℃保温15min。而后再加入1mL 1.0mmol/L DTNB溶液,50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲溶液定容,26℃下保温15min,412nm波长测定其吸光值A。

大蒜素含量计算方法如下:

C大蒜素=ΔA412×d/(2×14150ml/mmol)

ΔA412=A0-A

式中:d为总稀释倍数;在本实验中稀释倍数为10000。

1.2.3 大蒜精油的提取 选择颗粒完整、无霉烂的大蒜200g,大小不限。切去大蒜的鳞茎盘,去掉大蒜干枯鳞片叶备用。用破碎机破碎,在30℃下酶解1h。将酶解后的大蒜,按固液比1∶2加入394.5mL蒸馏水中,上锅蒸馏。电热套功率保持在50～75W,时间1.5h,收集蒸出料液备用。用二氯甲烷提取分离大蒜油,经硅胶脱水和活性炭脱色精制,得到大蒜精油。

1.2.4 大蒜精油的臭氧氧化 将1.2.3提取的大蒜精油配成一定浓度的乙醇溶液,按1.2.1实验步骤进行臭氧氧化。反应时间为4h,反应温度为8℃,臭氧流量为0.28L/min,臭氧氧化大蒜精油。用TLC法监测反应体系中的二烯丙基二硫醚已经反应完全,而后过柱分离,得到大蒜素粗品,再按步骤1.2.2的分析方法,计算大蒜素产率,公式如下：

式中：m(大蒜素)为反应得到的大蒜素质量；m(二烯丙基二硫醚)为反应物中所含二烯丙基二硫醚质量。

1.2.5 单因素实验

1.2.5.1 反应温度的影响 控制反应时间为3h,二烯丙基二硫醚乙醇溶液浓度为 0.4mmol/mL,臭氧流量为0.15L/min的情况下,改变反应温度,考察其对大蒜素产率的影响。每个实验点做三次重复。

1.2.5.2 反应时间的影响 在反应温度为20℃,二烯丙基二硫醚乙醇溶液浓度为0.4mmol/mL,臭氧流量为0.15L/min的条件下,考察反应时间对大蒜素产率的影响。每个实验点做三次重复。

1.2.5.3 臭氧流量的影响 在反应温度为20℃,二烯丙基二硫醚乙醇溶液浓度为0.4mmol/mL,反应时间为3h的条件下,考察臭氧流量对大蒜素产率的影响。每个实验点做三次重复。

1.2.5.4 原料浓度的影响 在反应温度为20℃,臭氧流量为0.15L/min,反应时间为3h的条件下,考察二烯丙基二硫醚乙醇溶液浓度对大蒜素产率的影响。每个实验点做三次重复。

1.2.6 Box-Behnken设计实验 应用Design Expert软件,根据Box-Behnken中心组合设计原理,以大蒜素的产率为响应值,在单因素实验结果的基础上,对反应温度、反应时间、臭氧浓度、原料浓度四个因素进行响应曲面实验设计。因素水平见表1。每个实验点做三次重复。

表1 响应面实验设计因素水平表

1.2.7 数据处理 以SPSS软件作统计学分析,实验数据以平均数标准差表示。

2 结果与讨论

2.1臭氧氧化合成大蒜素的影响因素探讨

2.1.1 反应温度对大蒜素合成产率的影响 由图1可知,在保持其他条件不变的情况下,大蒜素的产率先是随着反应温度的升高而增加,在10℃时产率达到最大值(46.99%),随后温度继续升高,产率下降,温度升到30℃时产率仅为27.34%。故选取温度0、10、20℃为响应面温度的三水平。

2.1.2 反应时间对大蒜素产率的影响 从图2可知,随着反应时间的增加,大蒜素的产率不断提高,反应至1h,大蒜素的产率为14.37%,反应进行到5h,产率达到40.12%。通过TLC法跟踪反应进程,当反应进行到4h时,产物中伴随有副产物的出现。故选取时间3、3.5、4h为响应面时间的三水平。

图1 反应温度对大蒜素产率的影响

图2 反应时间对大蒜素产率的影响

2.1.3 臭氧流量对大蒜素产率的影响 从图3可以看出,随着臭氧流量从0.10L/min增大到0.30L/min的过程中,大蒜素的产率呈现先上升后下降的趋势,当臭氧流量为0.20L/min时,大蒜素的产率最高为38.63%,之后随着臭氧流量的增大,大蒜素的产率反而下降。这可能是由于臭氧量增大到一定程度后,臭氧氧化了二烯丙基二硫醚中的两个双键,产生副产物。故选取臭氧流量0.15、0.20、0.25L/min为响应面臭氧流量的三水平。

图3 臭氧流量对大蒜素产率影响

2.1.4 原料浓度对大蒜素产率的影响 从图4可以看出,随着二烯丙基二硫醚的浓度不断增大,大蒜素的产率表现为先增加后减少,当二烯丙基二硫醚浓度为0.2mmol/mL时,大蒜素的产率最高,达到48.32%。随后,大蒜素的产率不断降低。故选取二烯丙基二硫醚浓度0.2、0.3、0.4mmol/mL为响应面二烯丙基二硫醚浓度的三水平。

图4 反应物浓度对大蒜素产率的影响

2.2运用响应面法分析影响因素并确定最优条件

2.2.1 臭氧氧化合成大蒜素的实验数据分析 以反应温度、反应时间、臭氧流量、原料浓度为四个可控的工艺参数,以大蒜素产率为实验指标,采用Box-Behnken设计方法来优化大蒜素合成工艺条件,实验设计方案及结果见表2。

表2 Box-Behnken设计实验的结果

表3 回归模型方差分析

注：*：p<0.05,表示显著；**：p<0.01,表示极显著。 通过Design-Expert软件,对表3实验数据进行多元回归拟合,获得了大蒜素产率对编码自变量反应温度、反应时间、臭氧流量、原料浓度的二次多元回归方程：Y(%)=30.38750+2.99725×A-98.03333×B+8.88167×C+91.23333×D+0.67250×A×B-0.20000A×C-1.26500×A×D-7.75000×B×C-40.50000×B×D-12.40000×C×D-0.12343×A2+131.79167×B2+0.011667×C2-38.33333×D2。该方程回归显著,R2=0.9803,说明回归方程的拟合程度良好,失拟较小,可以用该方程代替真实实验点进行分析。方程中A、B、C对吸光值的影响达显著水平,方程中A2、B2对吸光值的影响也达极显著水平。表明实验因子对响应值不是简单的线性关系。精密度>4.0是令人满意的,而本模型的精密度为23.83,说明模型适当。

2.1.5 响应面分析及反应的最优条件 采用Design-Expert软件分析了反应的最优化条件,得到臭氧氧化合成大蒜素的最佳条件为反应时间为4.0h,反应温度为8.06℃,臭氧通入量为0.28L/min,二烯丙基二硫醚浓度为0.18mmol/mL。为检验响应曲面法所得结果的可靠性,采用上述优化条件下合成大蒜素,测得大蒜素产率为59.53%,与理论预测值59.77%相比,其相对误差较小。因此,基于响应面分析法所得的臭氧氧化合成大蒜素的反应条件参数准确可靠,具有实用价值。

2.3大蒜精油的臭氧氧化

采用2.1.5提到的反应条件对大蒜精油进行臭氧氧化,大蒜素的综合产率为63.61%。该值比理论预测值59.77%要略高一些,原因可能是：大蒜精油包含二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、二烯丙基硫醚等混合物,这些化合物之间可以相互转化,并存在一定的化学平衡,在二烯丙基二硫醚氧化生成大蒜素的过程中,使上述平衡发生移动,生成了比理论值更多的大蒜素。我们将氧化后的大蒜精油进行抗氧化活性研究,与氧化前的大蒜精油相比,其抗氧化性得到显著提高,相关内容将另文发表。

3 结论

3.1 以单一的模型化合物二烯丙基二硫醚为反应原料,以臭氧为氧化剂,合成了大蒜素纯品。研究反应温度、反应时间、反应物浓度、臭氧流量对大蒜素产率的影响：大蒜素的产率随着反应时间的增加而提高,但是在反应时间超过4h后,有副产物二烯丙基三硫醚等产生；大蒜素产率随着反应温度、二烯丙基二硫醚浓度、臭氧流量的增加产率表现为先上升而后下降。

3.2 针对单因素反应温度、反应时间、反应物浓度、臭氧流量对大蒜素产率的影响,采用响应面法得到优化后的臭氧氧化合成大蒜素的反应条件：反应时间为4h,反应温度约为8℃,臭氧通入量为0.25L/min,二烯丙基二硫醚乙醇溶液浓度为0.20mmol/mL。

3.3 采用最优条件下,用臭氧氧化大蒜精油,测定大蒜精油中大蒜素反应前后的含量,大蒜素产率达到63.96%,说明最优条件下,采用臭氧氧化大蒜精油,可以获得富含大蒜素的大蒜精油,使大蒜精油的品质得到提升。

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Study on the synthesis of allicin by using ozone and the application of the method on garlic oil

LIWen-qing，ZHOUHua*,YANRi-an，HUANGXue-song，OUShi-yi

(Department of Food Science and Technology,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

In order to attain the higher yield of allin and higher content of that in garlic oil,the key effect factors were investigated:as the reaction time was prolonged,the yield of allicin was increased,but the byproduct of reaction was presented after more than four hours. As the reaction temperature and reactant concentration and the ozone flow increased,the yield of allicin was first increasing and then decreasing. The respond surface methodology was used to optimize the synthesis condition of the reaction:the reaction time was 4h,and the reaction temperature was about 8.06℃,and the ozone flow was 0.28L/min,and reactant concentration was 0.18mmol/mL. In the above optimized synthesized condition,the ozone was used to oxidize the garlic oil,the yield of allicin was 59.53%. The garlic oil with high content of allicin could be obtained and the quality of garlic oil could be improved in the above-mentioned optimized condition.

allicin;ozone;oxidation;garlic oil

2013-06-28 *通讯联系人

李文清(1987-)，男，硕士研究生，研究方向：大蒜化学。

国家自然科学基金(31101323)资助。

TS234.3

：B

：1002-0306(2014)01-0202-05