,,*, ,

(1.西南大学资源环境学院,重庆 400715； 2.西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆 400715； 3.西南大学药学院,重庆 400715)

超声波辅助提取山银花绿原酸工艺及其抗氧化性研究

刘亚敏1,2,刘玉民1,2,*,李琼3,尚艳双1,2

(1.西南大学资源环境学院,重庆 400715； 2.西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆 400715； 3.西南大学药学院,重庆 400715)

以山银花为材料,采用高效液相法检测绿原酸,建立了超声波辅助提取绿原酸的工艺组合。通过单因素实验研究了提取时间、固液比、超声波功率、超声波频率四个主要因素对绿原酸提取的影响。在单因素实验的基础上采用L9(34)正交实验优选山银花绿原酸提取工艺条件。结果表明：室温下,溶剂为体积分数为50%的乙醇,超声波辅助山银花绿原酸的最佳提取工艺组合为超声波提取50min、固液比1∶50、超声波功率300W、超声波频率59kHz,在此条件下绿原酸提取率达到88.7624mg/g。验证实验表明该工艺组合提取率高,稳定性良好。山银花绿原酸提取物有一定的还原能力和较好的清除DPPH自由基的能力,是很好的功能性食品资源。

山银花,绿原酸,超声波辅助提取,工艺优化

山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)、红腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)、华南忍冬(LoniceraconfuseDC.)或黄褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)的干燥花蕾或初开的花。味甘、寒,归肺、心、胃经,具有清热解毒,疏散风热的功效。用于治疗痈肿疔疮,喉痹,丹毒,热毒血痢,风热感冒及温热发病等[1]。现在研究发现山银花具有较强的抗动脉粥样硬化作用[2]。山银花提取物具有显著的抗病毒作用,体外对PRV和NDV具有明显的阻断、抑制和中和作用,其中山银花对PRV体外的抑制作用强于金银花[3-4]。山银花还被广泛应用于食品、饮料、保健品、化妆品和兽药等方面[5],市场需求量在逐年增加。绿原酸为山银花的主要活性成分之一,现代药理学研究表明,绿原酸具有广泛的抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、提高白细胞数量、降血脂、增强免疫调节、保肝利胆作用[6-12]。山银花中灰毡毛忍冬绿原酸含量较高,很适宜作为绿原酸的提取原料[13]。超声波提取技术是利用超声波辐射压强产生的机械振动、空化效应及扰动效应等,增加溶剂穿透力,从而加速目标成分进入溶剂,促进提取的进行。近年来被广泛的应用于药用植物活性成分的提取,具有节约能源、提高效率并且避免高温对有效成分的影响等优点[14]。目前绿原酸的提取多采用水提醇沉法、醇提铅沉法、石灰乳沉淀法等,这些传统方法提取效率较低且提取物中杂质较多,醇提铅沉还带来重金属铅污染[14]。本实验利用超声波可有效提高提取效率的特点,对超声波辅助提取山银花绿原酸工艺组合进行了研究,采用高效液相检测绿原酸[15],以绿原酸为考察指标,运用正交设计优选山银花绿原酸的最佳提取工艺组合,对目前几个主产地的山银花品种的绿原酸含量进行了检测,并对山银花的抗氧化能力进行了研究,以期对山银花的深度开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

山银花 采自重庆秀山山银花生产基地,经西南大学林学教研室鉴定为忍冬科灰毡毛属植物品种为渝蕾一号,新鲜花蕾经杀青烘干后粉碎过20目筛备用；甲醇、无水乙醇 为分析纯；乙腈、磷酸 为色谱纯；绿原酸标准品 色谱纯≥98%中国药品生物制品检定所；蒸馏水 实验室自制。

D-7000高效液相色谱仪 日本日立公司；数控超声波清洗机SG8200HBT 上海冠特超声仪器有限公司；电子天平FA2004B 上海越平科学仪器有限公司；SHB-3循环水多用真空泵 郑州杜甫仪器厂；RE-52旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1 绿原酸的测定方法 色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂,色谱柱型号为Allsphere ODS(250mm×4.6mm,2.5μm)；流动相为乙腈(A)和0.5%磷酸溶液(B)梯度洗脱,A：0～11min,10%～20%,11～21min,20%～25%,21～30min,25%～30%。流速1.0mL/min,进样量10μL,检测波长355nm,柱温30℃。

1.2.2 线性关系的考察 精确称取绿原酸对照品5g,70%甲醇溶解并定容于100mL容量瓶,摇匀,配制成浓度为50mg/mL绿原酸标准溶液。分别精确吸取绿原酸对照品溶液0、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0mL,分别置于50mL容量瓶中,以70%甲醇定容,按1.2.1色谱条件进行测定。

1.2.3 样品的制备 精确称取样品粉末于设定条件下进行提取(5个重复),超声波提取三次,滤液合并,挥干溶剂后用70%的甲醇定容于100mL容量瓶中,摇匀,从提取溶液中取1mL用70%的甲醇定容于50mL容量,于1.2.1色谱条件下进行测定,采用2.1回归方程进行计算。

式中：Y为山银花绿原酸提取率(mg/g)；C为依据回归方程计算的提取液中绿原酸的质量浓度(mg/mL)；V1为样品提取液的总体积(100mL)；V2为测定样品时定容体积(50mL)；V3为测定样品时取样体积(1mL)。

1.2.4 实验条件 提取时间筛选：于固液比1∶30,超声波功率200W,超声波频率40kHz条件下,设置提取时间为5、10、20、30、40、50、60min,研究提取时间对绿原酸提取率的影响。

固液比筛选：于超声波功率200W,超声波频率40kHz,超声波提取30min条件下,设置固液比为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,研究固液比对绿原酸提取率的影响。

超声波功率筛选：于固液比1∶30,超声波频率40kHz,超声波提取30min条件下,设置超声波功率为150、200、250、300、350、400W,研究超声波功率对绿原酸提取率的影响。

超声波频率筛选：于固液比1∶30,超声波功率200W,超声波提取30min条件下,设置超声波频率0、40、50、59kHz,研究超声波频率对山银花绿原酸提率的影响。

取来自不同产地的样品2g(5个重复),室温下,于正交优选条件下进行提取,采用高效液相色谱法检测绿原酸含量。

1.2.5 正交实验设计 根据单因素实验的结果,确定提取时间(A)、固液比(B)、超声波功率(C)、超声波频率(D)为实验因素,进行正交实验设计(提取溶剂为50%乙醇,于室温条件下),选用L9(34)正交设计表进行实验(表1),优化山银花绿原酸提取工艺。

表1 绿原酸正交实验水平表Table 1 Orthogonal experiment level tableof the chlorogenic acid

1.2.6 DPPH自由基清除率测定[16]精确取DPPH粉末0.001g,用无水乙醇溶解定容于100mL容量瓶中,配制成浓度0.01mg/mL溶液备用。将山银花绿原酸提取液配稀释成不同浓度梯度备用。各取不同浓度的稀释液2mL于试管中,加入2mL配制好的DPPH溶液摇匀,30min后,于517nm处测定其吸光度(A1)；以2mL无水乙醇替代2mL DPPH的测吸光度(A2)；以2mL无水乙醇替代2mL待测溶液吸光度(A0)。按照以下公式计算DPPH自由基清除率。

1.2.7 Fe3+还原力测定[16-17]取2.5mL不同浓度梯度的金银花绿原酸提取液,加入2.5mL 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH=6.6)和2.5mL 1%的铁氯化钾溶液,50℃水浴20min后快速冷却,加入10%三氯乙酸2.5mL,取以上混合液5mL,加蒸馏水4mL及0.1%三氯化铁溶液1mL,混合10min后于700nm处测定其吸光度。

1.3数据分析

用Microsoft Excel和DPS软件进行数据的统计分析。

2 结果与分析

2.1绿原酸检测结果

采用1.2.1检测方法对山银花提取液进行检测。根据1.2.2方法,以峰面积积分值(y)为纵坐标,对照品浓度(x)为横坐标绘制标准曲线,得回归方程：y=0.199x+0.0014,r=0.9997。本结果为计算绿原酸提取率的依据。

山银花提取液中含有大量绿原酸如图1所示,于保留时间20min处还有一主要成分峰。提取液中除2种主要成分外还含有10余种化合物。

图1 高效液相色谱

2.2山银花绿原酸提取的单因素实验

2.2.1 提取时间对绿原酸提取的影响 其它条件一定时,考察提取时间对提取效果的影响,结果见图2：随提取时间的延长,绿原酸提取率迅速增大,当超声波提取超过30min时,绿原酸的提取率增加速度变缓。考虑到绿原酸的有效溶出同时避免长时间局部高温对提取物化学结构的破坏并尽可能节约能源,正交实验设计中提取时间设置为30～50min。

图2 超声波提取时间对绿原酸提取率的影响

2.2.2 固液比对绿原酸提取的影响 其它条件一定时,考察固液比对提取效果的影响,结果见图3：随溶剂量的增加,绿原酸提取率逐渐增大,固液比1∶30后绿原酸提取率趋于稳定。原因可能是溶剂量增加后,浓度梯度变大,有利于绿原酸的溶出,从而使其溶出速度和提取率变大。当原料里的绿原酸充分溶出后,再增大溶剂量,绿原酸的提取率也不再增加。考虑到绿原酸有效的溶出,且不浪费溶剂,故正交实验设计中固液比的设置为1∶30～1∶50。

图3 固液比对绿原酸提取率的影响

2.2.3 超声波功率对绿原酸提取的影响 其它条件一定时,考察超声波功率对提取效果的影响,结果见图4：随超声波功率的增加,山银花绿原酸提取率逐渐增大,当超声波功率达到300W时,山银花绿原酸提取率达到最大值,超声波功率继续增大,山银花绿原酸提取率反而降低。这可能与超声波的空化效应有关,超声波提取中可以产生很多的微泡,这些小空洞迅速膨大闭合,引起微粒间的剧烈撞击,使液体局部温度骤然增高,高温使不稳定的绿原酸的邻二酚羟基结构被氧化分解从而使提取率有所下降[18-19]。为保证绿原酸的充分提取并避免化合物的分解以及节约能源,正交实验设计中超声波功率的设置为：250～350W。

2.2.4 超声波频率对山银花绿原酸提取的影响 其它条件一定时,考察超声波频率对提取效果的影响,结果见图5：室温下相同时间内使用超声波方法的提取效率远高于不使用者,随超声波频率增加，山银花绿原酸的提取率逐渐增加。这可能是由于超声波所具有的机械效应和温热效应,使细胞振荡、摩擦,并刺激细胞半透膜的弥散过程,超声波的频率越高分子震动的频率越高,具有的能量越大,细胞内物质向外渗出的速度越快。同时由于超声波具有的空化效应,产生很多的微泡,这些小空洞迅速的膨胀闭合,产生很好的搅拌作用,并能打碎细胞壁,加速绿原酸的向外溶出[18,20]。正交实验设计中超声波频率的设置为40～59kHz。

图4 超声波功率对绿原酸提取的影响

图5 超声波频率对绿原酸提取率的影响

2.3正交实验优化山银花绿原酸提取工艺

按照表1的因素水平,采用L9(34)正交实验方法,优选山银花绿原酸提取工艺(见表2),并对实验结果进行了方差分析(见表3)。结果表明：提取时间(A)、固液比(B)、超声波功率(C)、超声波频率(D)均对绿原酸的提取有极显著的影响；各因素的优先次序为D>B>C>A,即超声波频率>固液比>超声波功率>提取时间。通过极差分析及单因素多重比较确定最佳的工艺组合为A3B3C2D3。

从表2中可知,9组实验,提取效率最高的为实验3(A1B3C3D3),采用正交优选最佳工艺组合A3B3C2D3和A1B3C3D3两种提取工艺组合进行提取,绿原酸提取率分别为：88.7624、83.2274mg/g。结果表明,通过极差分析得到的山银花绿原酸的最佳提取工艺组合A3B3C2D3优于正交设计中的A1B3C3D3。室温下,溶剂为50%的乙醇(体积分数),超声波辅助山银花绿原酸提取的最佳工艺条件组合为：提取时间：50min,固液比：1∶50,超声波功率：300W,超声波频率：59kHz。

2.4正交优化组合稳定性实验

为验证优选工艺的可靠性及稳定性,依上述优选所得工艺条件进行5次平行实验,经检测绿原酸提取率平均为88.7624mg/g,相对标准偏差RSD为1.28%。结果：绿原酸得率较高且稳定性良好,适宜于生产应用。

2.5不同产地山银花的绿原酸含量检测

采用正交优选最佳工艺组合对不同产地山银花绿原酸进行提取检测,结果表明(见表4)：重庆秀山的灰毡毛忍冬和湖南隆回的灰毡毛忍冬系列品种(金翠蕾、湘银翠蕾、白云)绿原酸含量明显高于产自广西上思的华南忍冬、贵州安龙的黄褐毛忍冬和广西忻城的红腺忍冬。

表2 正交实验结果

表3 绿原酸正交实验方差分析

注：F0.01(2,18)=6.01。

2.6山银花提取液对DPPH自由基清除作用

如图6中所示,抗坏血酸、绿原酸、山银花提取液均对DPPH自由基有很好的清除效果。山银花提取液和绿原酸标品在低浓度时对DPPH自由基的清除能力远高于抗坏血酸,呈线性增长。山银花提取液和绿原酸分别于浓度10、15μg/mL清除率达到90.22%和93.25%。在低浓度范围时山银花提取液对DPPH自由基的清除率高于绿原酸,这可能与金银花提取液中所含黄酮类、酚类、皂苷类等化合物有关(如图1所示),但浓度大于15μg/mL后,清除能力相当,表明在山银花提取液中绿原酸是主要的抗氧化成分。

表4 不同产地山银花绿原酸含量测定

图6 山银花提取液、抗坏血酸和绿原酸 对DPPH自由基的清除作用

2.7山银花提取液对Fe3+还原作用

植物中含有多种抗氧化物质,可使Fe3+还原成Fe2+,通过比色法测定,在700nm处吸光度值越大,其还原能力越强。如图7所示抗坏血酸具有较强的还原性,随浓度增大抗坏血酸对Fe3+的还原能力逐渐增大。山银花提取液和绿原酸在低浓度时,还原能力较差两者相差不大。山银花提取液浓度大于40μg/mL后,随浓度的增大还原能力有大幅的增加。

图7 山银花提取液、绿原酸和抗坏血酸还原能力测定

3 结论与讨论

本研究对超声波辅助山银花绿原酸的提取工艺组合进行了实验,通过数据分析可知：提取时间、固液比、超声波功率和超声波频率均对山银花绿原酸提取有极显著的影响,影响的大小依次为超声波频率>固液比>超声波功率>提取时间；通过极差分析及单因素多重比较确定最佳的工艺组合为A3B3C2D3,即提取时间50min,固液比1∶50,超声波功率300W,超声波频率59kHz。在此条件下绿原酸提取率达到88.7624mg/g。

山银花绿原酸提取物具有一定的还原能力,且随浓度增加还原能力有较大的增加。山银花绿原酸提取液在低浓度时即表现较好的清除DPPH自由基的能力,当浓度为10μg/mL时其清除率可达到90.22%。低浓度时的清除能力远高于抗坏血酸。山银花绿原酸提取液具有一定的还原能力和较好的清除DPPH自由基的能力,可作为抗氧化的功能性食品进行进一步开发利用。

植物有效成分的提取中,原料的粉碎度对提取有一定的影响,植物的次生有效成分,存在于细胞内,通过对原料的处理,使其颗粒变小,增加与溶剂的接触面积,便于有效成分的提取[20-21]。本实验中实验原料为植物的花蕾,前期实验发现原料20目即可很好的满足实验的需要,这可能与超声波的强大穿透能力和机械效应有关。虽然植物有效成分提取中,温度也为非常重要的一个因子,但由于超声波的空化效应和热效应的存在,无法明确设定温度对山银花绿原酸提取率的影响,故本次未将其设定为参考因子。

超声波提取技术工艺运行成本低,操作简单易行,并且提取温度低,可以保护有效成分。超声波提取技术的运用可以大大提高山银花绿原酸提取效率并且节约能源,具有推广价值。山银花绿原酸含量高,非常适合作为绿原酸工业化生产的原料,不同产地不同品种的山银花绿原酸含量有一定的差异,在引种中应选择适应当地条件的优良品种进行发展。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of chlorogenic acid fromLoniceramacranthoidesHand.-Mazz.

LIUYa-min1,2,LIUYu-min1,2,*,LIQiong3,SHANGYan-shuang1,2

(1.College of Resources and Environment,Southwest University,Chongqing 400715,China； 2. College of Life Sciences,Southwest University,Chongqing 400715,China; 3. College of Pharmaceutical sciences,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The object of this research was to optimize ultrasonic-assisted extraction process of chlorogenic acid fromLoniceramacranthoidesHand.-Mazz. The chlorogenic acid was tested by HPLC. To maximize the extraction of chlorogenic acid,main technological parameters like ultrasonic extraction time,ethanol concentration,solid/liquid ratio and temperature,were investigated by single factor method coupled with L9(34)orthogonal array design. Results showed that the optimal conditions of extracting chlorogenic acid fromLoniceramacranthoideswas 50% ethanol,ultrasonic power 300W,ultrasonic frequency 59kHz,extracting 50min,with a solid/liquid ratio of 1∶50.Under above conditions,the extraction yield of chlorogenic acid reached 88.7624 mg/g. It was proved that this extracting technology was reasonable and feasible. The results demonstrated that extract fromLoniceramacranthoideshad certain reduction capacity and potent DPPH radical scavenging capacity and could be used as antioxidants and in functional foods.

LoniceramacranthoidesHande-Mazz.;chlorogenic acid;ultrasonic-assisted extraction;optimization

2013-06-17 *通讯联系人

刘亚敏(1976-)，女，硕士，副教授，主要从事药用植物资源利用方向的研究。

国家自然科学基金面上项目(31170546)；中央高校基本业务费专项(XDJK2010C042)；国家林业局公益性行业科研专项(201004043)；西南大学生态学重点学科“211工程”建设项目。

TS201.1

：B

：1002-0306(2014)01-0186-06