殷玉生，张 帆，安榆林

(1.江阴出入境检验检疫局，江苏 江阴 214431； 2.江苏出入境检验检疫局，江苏 南京 210009)

基于线粒体COI基因鉴定大小蠹属昆虫

殷玉生1，张 帆1，安榆林2

(1.江阴出入境检验检疫局，江苏 江阴 214431； 2.江苏出入境检验检疫局，江苏 南京 210009)

以口岸经常截获的红脂大小蠹、黄杉大小蠹、山松大小蠹、间大小蠹、红翅大小蠹和落叶松大小蠹等6种大小蠹属昆虫为样本，根据其昆虫检索表制作了近缘关系树；利用分子手段对其线粒体COI基因进行扩增，分析同源序列的多样性、遗传距离和系统进化关系，并将近缘关系树和分子进化树进行比较，研究利用分子手段对大小蠹属昆虫进行快速鉴定的可行性和准确性。结果表明：同种的大小蠹碱基差异较小，而不同种间的碱基差异较大，能明显区分出不同种；大小蠹属的遗传距离和邻接法系统进化树也证实，分子鉴定结果和检索表分类的结果一致。可利用分子鉴定的方法对不同种的大小蠹属昆虫进行快速准确的鉴定。

大小蠹属；形态学；COI基因；分子鉴定

大小蠹属(Dendrotonus)隶属于鞘翅目(Coleptera)小蠹科(Scolytidae)海小蠹亚科(Hylestininae)根小蠹族(Hylurgini)，是重要的林木害虫，主要危害松属、云杉属、黄杉属和落叶松属等，该属(非中国种)被列入我国进境植物检疫性有害生物名录。大小蠹属在全世界共记录19种，中、北美洲分布17种，欧洲和亚洲共2种，我国本土大小蠹仅有华山松大小蠹(Dendroctonusarmandi)和云杉大小蠹(D.micans)。大小蠹属害虫在大爆发时，寄主选择专一性变弱，可以危害所有的针叶树种。例如1955—1984年间加拿大不列颠哥伦比亚省的云杉受到了红翅大小蠹(D.rufipennis)的攻击，造成了1400万m3的云杉受损；落叶松大小蠹(D.simple)曾经在美国造成了落叶松林超过10%的树木死亡[1]。

北美是我国进口圆木的主要来源地之一，材种均为针叶树，都是该属的寄主，而我国纬度和气候条件均与北美相似，利于大小蠹属的定殖，因此一旦有大小蠹进入我国，极有可能扩散为害。最典型的例子即为红脂大小蠹(D.valens)，该虫于20世纪80年代传入我国，1999年在山西爆发成灾，造成数万公顷的油松死亡[2]。目前该虫已扩散到河南、河北、陕西、甘肃5省，对我国生态系统安全构成严重威胁[3]。邓皓中[4]通过计算大小蠹属昆虫重要潜在外来入侵种的危险性综合评估风险值来评判大小蠹昆虫的风险等级，结果显示山松大小蠹、南松大小蠹(D.frontalis)、红翅大小蠹、西松大小蠹(D.brevicomis)、黄杉大小蠹和落叶松大小蠹为高度危险级，云杉大小蠹和红脂大小蠹为中度危险级。

近年来，我国口岸频繁截获大小蠹属昆虫，对大小蠹属昆虫进行准确、快速的鉴定可以有效阻止其入侵，目前主要依据其形态学特征列出的昆虫分类检索表(identification key)对大小蠹属进行分类鉴定。分类检索表是鉴定昆虫种类的工具，它广泛应用于各分类阶元的鉴定。检索表的编制是用对比分析和归纳的方法，从不同阶元(目、科、属或种)的特征中选出比较重要、突出、明显而稳定的特征，根据它们之间的相互绝对性状，作成简短的条文，按一定的格式排列而成。能够反映一定的生物进化关系，是昆虫分类工作重要的基础。

但在检疫过程中，由于大小蠹属常以幼虫等非成虫虫态出现，现有的鉴定方法和口岸快速鉴定技术尚不完善等原因，有1/3截获的害虫未能鉴定到种[4]，这对于我国的有害生物检验检疫工作造成不利影响。因此，需要探索新的鉴定技术弥补现有鉴定手段的不足。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(mtDNA COI)基因结构相对保守，而种间变异较大，利用COI基因进行近缘种间的鉴定和系统进化研究已经得到广泛应用。如Stauffer等[5]使用COI基因序列，鉴定了欧洲的7种齿小蠹，常虹等[6]应用基于COI基因片段的DNA条形码成功进行了齿小蠹属昆虫的分类鉴定。

大小蠹属作为重要的检疫性有害生物，对其进行快速鉴定具有重要意义。殷玉生等[7]测定了红脂大小蠹等5种大小蠹的COI基因片段，发现利用COI可以较好地反应大小蠹样本的来源地。本文收集了6种口岸经常截获的大小蠹样本，并将这6种常见大小蠹属昆虫根据其昆虫检索表制作了近缘关系树；利用分子手段对其线粒体COI基因进行扩增，分析了同源序列的多样性、遗传距离和系统进化关系，并将近缘关系树和分子进化树进行比较，研究利用分子手段对大小蠹属昆虫进行快速鉴定的可行性和准确性。

1 材料与方法

1.1 试验样本

供试样本为来自世界各地的6种大小蠹，每种选取3个重复，具体情况见表1。

1.2 试验过程

1.2.1 形态学鉴定分析 根据大小蠹属昆虫检索表[8]，利用Edraw mind map简化绘制了形态学上的大小蠹属种间关系树。

1.2.2 分子方法鉴定

1)DNA提取。将供试样本使用磁珠法[9]提取DNA，设计特异性引物进行PCR扩增。

2)PCR扩增。反应体系：DNA模板1 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1) 2.0 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)2.0 μL，上下游引物(10 mmol·μL-1)各1 μL，ExTaqDNA聚合酶(250 U) 0.3 μL，加水补足25 μL。

表1 供试大小蠹信息

引物：上游：5’-TCGCATATTATTAGGCAAGAAAGAG-3’； 下游：5’-AGAAATGTTGTGGGAAGAAAG-3’。

反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，47 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

序列分析：取扩增成功的PCR产物50 μL，直接送金斯瑞生物科技有限公司进行测序，以PCR引物为测序引物进行双向测序。

1.3 数据分析方法

利用Edraw mind map绘制大小蠹属种间关系树。所得大小蠹COI序列用分子遗传进化分析软件MEGA 3.0[10]进行比对，并计算遗传距离，用其中的邻近距离法构建基于COI序列的大小蠹属昆虫个体的NJ系统进化树，以Kimura 2-paramete为模型，系统树分支的置信度采用自展法重复检测1000次。

图1 大小蠹属形态特征的种间关系

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定分析

根据大小蠹属昆虫检索表[8]，选取红脂大小蠹、红翅大小蠹、黄杉大小蠹、山松大小蠹、落叶松大小蠹和间大小蠹6种大小蠹，将这6种大小蠹按照形态特征[6]做出近缘关系图(图1)。从图1可以看出依形态特征分类，这6种大小蠹主要分为2大支系：红脂大小蠹单独成为一支系，其它大小蠹为第2支系。在第2支系中，落叶松大小蠹和黄杉大小蠹关系较近，组合在一起，它们又与红翅大小蠹的关系相对密切；而山松大小蠹和间大小蠹的亲缘关系较近，组合在一起。

2.2 序列比对分析

利用特异引物对大小蠹属6个种(红脂大小蠹、红翅大小蠹、山松大小蠹、黄衫大小蠹、落叶松大小蠹和间大小蠹)共18个样本的mtDNA COI基因进行PCR扩增，对测序后的目的条带进行拼接裁剪后，片段大约为530 bp(图2)。

将克隆到的COI基因到NCBI网站上进行BLAST搜索，结果证实克隆得到的18条COI基因均属于大小蠹属COI基因序列，且同源性为99%，说明克隆的序列准确可靠。

对6种大小蠹COI序列比对发现，所有变异均为碱基置换，未发现碱基的缺失和插入；其中变异位点为147个，保守位点383个。该段序列A、T、G、C含量分别为20.53%、38.41%、15.96%、15.10%；A+T含量较高，为68.94%，明显高于G+C含量，表现出A+T的偏好性，符合昆虫线粒体基因碱基组成的基本特征。同种大小蠹碱基差异较小而不同种间的碱基差异较大。结果显示不同种大小蠹的COI序列有各自明显的特征序列，能够清晰地区分出大小蠹的不同种。

2.3 遗传距离分析

计算所测试样本的种内和种间遗传距离(表2)，发现种内平均遗传距离在0～0.039之间，种间平均遗传距离在0.084～0.181之间。其中，黄杉大小蠹、落叶松大小蠹和间大小蠹的3个样本的种内遗传距离为0，表明所有的3个样本在所测COI部分基因序列中没有发生任何变异；红翅大小蠹种内的遗传距离最大，达0.039，表明所选取的红翅大小蠹样本在COI部分基因序列上存在较大的变异。

形态学鉴定表明，黄杉大小蠹与落叶松大小蠹的形态特征较为接近，对这2种大小蠹COI基因部分序列进行距离分析发现，这2种大小蠹之间的遗传距离最小，为0.084。试验样本中山松大小蠹与间大小蠹间的遗传距离为0.102，对比形态学鉴定近缘关系图发现，这2种大小蠹的形态特征也较为接近。

2.4 系统进化树分析

基于6种大小蠹共18个样本的COI基因构建的系统进化树(图3)显示，落叶松大小蠹与黄杉大小蠹聚在一起，说明它们之间的亲缘关系最近，它们又与红翅大小蠹的亲缘关系较为接近，这与形态学鉴定的结果一致。间大小蠹和山松大小蠹的亲缘关系最近，与红脂大小蠹较远，与形态学鉴定结果一致。由图3可以看出，同一种大小蠹聚在同一小支；近缘种聚在一起，如黄杉大小蠹和落叶松大小蠹，说明利用COI基因可以区分不同种的大小蠹。

图2 6种大小蠹的COI部分基因序列比对结果

红脂大小蠹山松大小蠹黄杉大小蠹红翅大小蠹间大小蠹落叶松大小蠹红脂大小蠹0.027山松大小蠹0.1610.003黄杉大小蠹0.1520.1230红翅大小蠹0.1810.1650.1570.039间大小蠹0.1680.1020.1120.1750落叶松大小蠹0.1580.1050.0840.1490.1400

以Xylothrips flavipes的COI基因序列为外群；分支置信度为1000次重复得到的自展值。 图3 邻接法构建的6种大小蠹的系统进化树

3 结论与讨论

随着生物科学的发展，分子技术在昆虫鉴定上的应用越来越广泛，早在1998年，安榆林等[11]就应用RAPD技术分析松墨天牛(Monochamusalternatus)、云杉大墨天牛(M.urussovi)和云杉小墨天牛(M.sutor)的DNA多态性，证实该技术可以有效鉴定天牛幼虫。也有研究表明：利用mtDNA Cytb基因对果实蝇属的橘小实蝇(Bactroceradorsalis)、瓜实蝇(B.cucurbitae)、南瓜实蝇(B.tau)、番石榴实蝇(B.correcta)、具条实蝇(B.scutellata)、黑漆实蝇(B.scutellaris)共6种实蝇进行分析，对6种实蝇共72个个体的mtDNA Cytb基因进行扩增测序，得到38种单倍型，发现了116个变异位点中的30个较为稳定，结果表明mtDNA Cytb基因可以作为这6种实蝇种类鉴别的分子标记[12]。

据报道，近年来我国口岸所截获的大小蠹属以黄杉大小蠹、红翅大小蠹和山松大小蠹居多，这3种大小蠹被定为高度危险级[4]。口岸检疫作为防治大小蠹害虫传入我国的重要防线有着不可替代的作用，因此我国的学者和检疫工作者对大小蠹属的鉴定也越来越重视。目前对大小蠹属成虫的形态学鉴定基本成熟，鉴定特征日趋完善，但在检疫工作中，截获标本的很大部分为早期形态(卵、幼虫和蛹)的昆虫或肢体残缺的虫体，这些虫态的鉴定特征较为接近，难以单纯的根据形态学特征对不同种类的大小蠹昆虫进行鉴定。近年来分子标记技术越来越多的用于昆虫种类鉴定，如邱宝利等[13]成功的利用分子标记技术对烟粉虱寄生蜂-蚜小蜂进行分类鉴定。岳巧云等[14]利用COI基因对米象(Sitophilusoryzae)、玉米象(Sitophiluszeamais)等昆虫的幼虫进行种类鉴定，结果表明DNA条形码技术能准确进行昆虫幼虫种类的鉴定。

本研究选取红脂大小蠹、红翅大小蠹、中欧山松大小蠹、黄杉大小蠹、间大小蠹和落叶松大小蠹共6种大小蠹，对其线粒体COI基因进行测序，并计算供试样本的种内和种间遗传距离，研究发现，种内平均遗传距离为0.012，黄杉大小蠹与落叶松大小蠹的种间遗传距离最小，为0.084；山松大小蠹与间大小蠹间的遗传距离为0.102，COI基因鉴定结果均符合形态特征的鉴定结果，说明利用COI的该片段可以很好的区分大小蠹属的不同种类。同时，基于Kimura 2-parameter模型构建了6种大小蠹属的NJ系统进化树，结果显示，同一物种可以聚为同一小支；近缘种聚集在一起，进化树结果与形态学鉴定结果一致，能够满足大小蠹属不同种类的鉴定需要。研究结果表明，将形态特征和分子生物学手段结合起来，能够有效提高大小蠹昆虫鉴定的准确率和速度，对口岸工作人员在工作中快速检疫大小蠹属昆虫有着积极作用。

[1]Wood SL.The bark and ambrosia beetles of North and Central America (Coleoptera：Scolytidae)，a taxonomic monograph[J].Great Basin Naturalist Memoirs，1982，6：1-1359.

[2]李计顺，常国彬，宋玉双，等.实施工程治理控制红脂大小蠹虫灾—对红脂大小蠹暴发成因及治理对策的探讨[J].中国森林病虫，2001，20(4)：41-44.

[3]苗振旺，赵明梅，王立忠，等.强大小蠹植物源引诱剂林间应用技术[J].昆虫知识，2003，40(4)：346-350.

[4]邓皓中.大小蠹属重要物种传入中国的风险分析[D].广州：中山大学硕士论文，2009：Ⅲ-Ⅳ.

[5]Stauffer C.A molecular method for differentiating sibling species within the genus Ips[A].Integrating cultural tactics into the management of bark beetle and reforestation pests，1997：87-91.

[6]常虹，郝德君，肖荣堂，等.基于线粒体COI基因的齿小蠹属昆虫DNA条形码研究[J].昆虫学报，2012，5(9)：1075-1081.

[7]殷玉生，张帆，钱路，等.大小蠹来源地的COI基因标记[J].生物安全学报，2012，2(3)：179-187.

[8]姚剑，殷玉生，余晓峰，等.世界大小蠹研究[J].安徽农业科学，2009，37(16)：7533-7535，7606.

[9]郑斯竹，安榆林，徐梅，等.多年保存天牛科标本的DNA微量提取方法[J].植物检疫，2009，26(3)：30-34.

[10]Kumar S，Nei M，Dudley J，et al.MEGA：a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequence[J].Briefings in bioinformatics，2008，9(4)：299-306.

[11]安榆林，刁彩华，朱宏斌，等.墨天牛属三个近缘种的RAPD分析[J].南京林业大学学报：自然科学版，1998，22 (4)：35-38.

[12]朱振华，叶辉，张智英.基于mtDNA Cytb的六种果实蝇的分子鉴定(双翅目：实蝇科)[J].昆虫学报，2005，48 (3)：386-390.

[13]邱宝利，任顺祥，温硕洋.分子标记在烟粉虱蚜小蜂分类中的应用[J].华东昆虫学报，2005，14(1)：5-8.

[14]岳巧云，邱德义，黄艺文，等.DNA条形码技术在未知昆虫幼虫种类鉴定中的应用[J].中国卫生检验杂志，2011，21(3)：615-617.

Identification ofDendrotonusInsects Based on the Mitochondrial COI Gene

YIN Yu-sheng1，ZHANG Fan1，AN Yu-lin2

(1.JiangyinEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Jiangyin214431，Jiangsu，China；2.JiangsuEntry-exitInspectionandQuarantineBureauNanjing210009,Jiangsu,China)

TakingDendrotonusvalens，D.pseudotsug，D.ponderosae，D.adjunctus，D.rufipennisandD.simplex6Dendrotonusspecies often intercepted in ports as the smaples，this paper constructed a Close Sib Relationship Tree；it used molecule measures to amplify mitochondrial COI genes，it analysed the relationships among same source sequence diversity，heredity distance and system evolution，and Close Sib Relationship Tree and Molecule Evolution Tree were compared，and it researched the feasibility and accuracy ofDendrotonusinsects rapid identification with the molecular techniques.The results showed that the homogeneousDendrotonusbases had the small difference and different kinds of it had the larger difference，the different species could be clearly distinguished；theDendrotonusgenetic distance and Neighbour-Joining System Evolution Tree also confirmed that the molecular identification results and the retrieval table classification results were the same.The molecular identification methods were used to do the fast accurate identification for different kinds ofDendrotonusinsects.

Dendrotonus；morphology；COI gene；molecular identification

10.13428/j.cnki.fjlk.2014.01.014

2013-06-17；

2013-07-26

科技部质检公益性行业科研专项(201110038)；江苏出入境检验检疫局基金课题(2008KJ37)

殷玉生(1971—)，男，安徽枞阳人，江阴出入境检验检疫局农艺师，硕士，从事植物检疫工作。E-mail：yinys@jsciq.gov.cn。

S786.38

A

1002-7351(2014)01-0063-05