田 杰 李慧萍 任配友 刘春禹 李 锐

(长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031)

姜黄素是姜科姜黄根茎中发现的一种酚性色素，研究表明，姜黄素能够预防多种疾病，如糖尿病，肥胖，癌症等，尤其作为一种具有良好发展前景的抗癌新药，具有抗癌谱广、毒副作用小的优点，可抑制多种体外建株肿瘤细胞的生长〔1〕，其作为化学预防药物的研究已进入临床试验阶段〔2,3〕。在肝癌的研究方面，姜黄素对HL-7702人肝癌细胞增殖的影响尚未见报道。本实验通过研究姜黄素对HL-7702增殖的影响明确姜黄素的抗肝癌能力，并通过观察其对AMP蛋白激酶(AMPK)的激活作用初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 姜黄素购于美国Sigma公司；HL-7702人肝癌细胞购于ATCC；RPMI-1640培养液、胎牛血清购于Hyclon公司；AMPK激活剂(AICAR)、AMPK抑制剂(compound C)购自美国Selleckchem公司；抗体购自美国Abcam公司。

1.2肿瘤细胞的培养与传代 HL-7702人肝癌细胞于含10%胎牛血清(BAS)的RPMI1640培养液中，于37℃、5% CO2孵箱中培养，采用0.25%胰酶消化传代。

1.3噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况 取对数生长期的HL-7702细胞，消化，计数，用含10%BSA的 RPMI1640 培养液配制成 1×105个/ml 的细胞悬液，充分吹打后接种于 96 孔板中，100 μl/孔。 将培养板置于培养箱中培养。次日加药处理，继续培养48 h后，吸去培养基，换无血清的 RPMI1640，并加入MTT10 μl，继续培养4 h。小心吸弃培养上清液，每孔加入150 μl二甲基亚矾(DMSO)，震荡混匀10 min 后，酶标仪上490 nm处测定各孔的吸光度A值。 按下列公式计算：细胞增殖抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.3.1检测姜黄素对细胞增殖的影响 接种于96孔板的细胞，次日贴壁后分别更换含姜黄素的培养液至姜黄素终浓度为0、50和100 μmol/L，每个浓度设 5 个复孔。加药48 h后以0 μmol/L姜黄素的增殖率为100%，检测50和100 μmol/L姜黄素剂量组的细胞增殖抑制率。

1.3.2检测姜黄素与AICAR联合应用对细胞增殖的影响 细胞接种的次日，分别加入含0、50、100 μmol/L姜黄素，0.125 mmol/L AICAR，50 μmol/L姜黄素联合AICAR，100 μmol/L姜黄素联合AICAR。加药48 h后以0 μmol/L姜黄素的增殖率为100%，检测50、100 μmol/L姜黄素及联合用药组的细胞增殖抑制率。

1.3.3检测姜黄素与compound C联合应用对细胞增殖的影响 细胞接种的次日，分别加入含0、50、100 μmol/L姜黄素，0.005 mmol/L compound C，50 μmol/L姜黄素联合compound C，100 μmol/L姜黄素联合compound C。加药48 h后以0 μmol/L姜黄素的增殖率为100%，检测50、100 μmol/L姜黄素及联合用药组的细胞增殖抑制率。

1.4Western印迹方法检测姜黄素对HL-7702细胞AMPK表达及活化的影响 HL-7702细胞分别用0、50、100 μmol/L浓度姜黄素处理48 h后，用磷酸盐缓冲剂(PBS)洗3次，用蛋白刮将细胞刮下，超声裂解细胞，离心，取上清蛋白溶液，蛋白定量后取40 μg蛋白加入5×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上样缓冲液，100℃煮沸5 min，12% SDS-PAGE电泳分离，100 V转膜1.5 h，用3% BSA的Tris盐酸缓冲液(TBST)封闭，TBST洗膜，依次加入一抗、二抗进行免疫结合，AP显色。以β-actin为内参照，计算相对光密度(A)值。目的蛋白的相对光密度值=(目的蛋白条带光强度×平均光密度)/(同一样品β-actin条带光强度×平均光密度)。实验重复3次，计算各组光密度A值的均值与标准差。以目的蛋白的相对光密度(A)值间接表示蛋白含量。A越大，蛋白含量越高。

2 结 果

2.1姜黄素对HL-7702增殖的影响 结果显示，与0 μmol/L剂量组相比，50 μmol/L和100 μmol/L姜黄素剂量组细胞增殖明显受到抑制，抑制率分别为83.5%±3.1%和90.5%±3.6%(P<0.001)。

2.2姜黄素对HL-7702中AMPK表达及活化的影响 与0 μmol/L剂量组相比，50 μmol/L和100 μmol/L姜黄素剂量组细胞中AMPK及磷酸化AMPK的含量显著增高。见图1。

图1 不同浓度姜黄素处理后HL-7702细胞中AMPK的表达与活化

2.3姜黄素与AICAR联合应用对细胞增殖的影响 与0 μmol/L剂量组相比，单独应用AICAR组细胞的增殖抑制率为23.6%±6.3%(P<0.05)，与50 μmol/L和100 μmol/L剂量组相比，姜黄素与AICAR联合应用对细胞增殖的抑制率无明显改变(P>0.05)。

2.4姜黄素与compound C联合应用对细胞增殖的影响 与0 μmol/L剂量组相比，单独应用compound C组细胞的增殖情况无明显改变(P>0.05)；与50 μmol/L和100 μmol/L剂量组相比，姜黄素与compound C联合应用时，细胞的增殖抑制率分别下降至77.6%±4.9%(P<0.001)和81.1%±3.4%(P<0.01)。

2.5姜黄素与AICAR和compound C联合应用对细胞增殖的影响 与单独使用姜黄素组，以及姜黄素与AICAR联合应用组相比，姜黄素与AICAR和compound C联合应用时，细胞的增殖情况无明显改变；与姜黄素联合compound C组相比，姜黄素与AICAR和compound C联合应用后，HL-7702细胞的抑制率分别上升为84.1%±5.1%(P<0.001)和90.9%±3.6%(P<0.01)。

3 讨 论

姜黄素是从姜科、天南星科一类植物的根茎中提取的天然食用色素，研究表明，姜黄素具有抗氧化、抗肿瘤、抗血管生成以及抗炎等作用〔4〕，对许多疾病还具有预防作用〔5〕，其因价格低廉、药理作用广泛和潜在的抗肿瘤作用而备受关注。本实验结果显示姜黄素可抑制HL-7702人肝癌细胞的增殖，且抑制程度具有浓度依赖性。

Western印迹结果显示，姜黄素作用后HL-7702细胞中AMPK与p-AMPK均上调，提示姜黄素可能通过激活AMPK从而抑制HL-7702细胞增殖。AMPK是一种高度保守的能量敏感的丝/苏氨酸激酶，其活性受 AMP/ATP 比例调节〔6〕。AMPK作为“能量感受器”在糖调节及脂类代谢如脂肪酸氧化、脂肪形成、蛋白质与胆固醇形成中发挥关键作用。研究发现，肿瘤细胞及其周围细胞中AMPK活性降低并伴随以上生理过程发生重要改变〔7，8〕。研究证明，AMPK在细胞程序性死亡及细胞凋亡中发挥重要作用〔9，10〕，因此AMPK成为肿瘤预防和治疗的新靶点〔11〕。

本实验结果显示姜黄素与AICAR联合使用对HL-7702增殖的抑制作用与单一使用姜黄素处理组相比无明显差异，可能是由于姜黄素已使AMPK充分激活，联合应用AICAR后，AMPK并未得到进一步的激活。而将不同浓度姜黄素联合AMPK抑制剂compound C处理HL-7702细胞后，联合组对HL-7702细胞增殖的抑制作用较单一姜黄素处理组减弱，提示姜黄素联合compound C时，compound C部分抵消了姜黄素对AMPK的激活作用，故对HL-7702细胞增殖的抑制作用减弱。而三者联合应用时，AICAR与compound C对AMPK的激活和抑制作用相互抵消，进一步证明姜黄素对HL-7702细胞增殖的抑制作用与激活AMPK有关。

4 参考文献

1赵毅辉，李德俊，王顺金. 姜黄素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响 〔J〕. 实验与检验医学, 2010;28(2):130-3.

2Goel A, Kunnumakkara AB, Aggarwal BB. Curcumin as “Curecumin” from kitchen to clinic〔J〕. Biochemi Pharmacol, 2008;75(4):787- 809.

3Anand P, Sundaram C, Jhurani S,etal. Curcumin and cancer: an "old-age" disease with an “age-old” solution〔J〕. Cancer Lett, 2008;267(1):133-64.

4Shieh JM, Chen YC, Lin YC,etal. Demethoxycurcumin inhibits energy metabolic and oncogenic signaling pathways through AMPK activation in triple-negative breast cancer cells〔J〕. J Agric Food Chem,2013;61(26):6366-75.

5Sa G, Das T. Anti cancer effects of curcumin:cycle of life and death 〔J〕. Cell Div, 2008;3:14.

6Hung CM, Su YH, Lin HY,etal. Demethoxycurcumin modulates prostate cancer cell proliferation ia AMPK-induced down-regulation of HSP70 and EGFR〔J〕.J Agric Food Chem, 2012;60: 8427-34.

7Kanga C, Kim E. Synergistic effect of curcumin and insulin on muscle cell glucose metabolism〔J〕. Food Chem Toxicol, 2010;48(8-9): 2366-73.

8Brown KA, Samarajeewa NU, Simpson ER. Endocrine-related cancers and the role of AMPK〔J〕. Mol Cell Endocrinol, 2013;366(2):170-9.

9Hardie DG. The AMP-activated protein kinase pathway: new players upstream and downstream〔J〕.J Cell Sci,2004;117(23):5479-87.

10Dagon Y, Avraham Y, Berry EM. AMPK activation regulates apoptosis, adipogenesis, and lipolysis by eIF2alpha in adipocytes〔J〕. Biochem Biophysi Res Commun,2006;2340(1): 43-7.

11Lee YK, Lee WS, Hwang JT,etal. Curcumin exerts antidifferentiation effect through AMPK r-PPAR- γ in 3T3-L1 adipocytes and antiproliferatory effect through AMPKr-COX-2 in cancer cells〔J〕.J Agric Food Chem, 2009;57(1):305-10 .