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PSGL—1+/—;IL—2—/—小鼠模型的构建

2014-09-02杨扬等

中国现代医生 2014年23期
关键词:糖蛋白白介素配体

杨扬等

[摘要] 目的 构建PSGL-1+/-;IL-2-/-小鼠模型。 方法 将白介素2敲除(IL-2 KO)小鼠与P-选择素糖蛋白配体-1敲除(PSGL-1 KO)小鼠杂交,剪尾提DNA后用PCR法检测小鼠的基因型。 结果 IL-2 KO小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交三代后,PSGL-1+/-;IL-2-/-小鼠模型构建成功。 结论 将IL-2 KO小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交三代后,成功建立了PSGL-1+/-;IL-2-/-小鼠模型。

[关键词] P-选择素糖蛋白配体-1;白介素-2;P-选择素糖蛋白配体-1敲除小鼠;白介素-2敲除小鼠;动物模型

[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2014)23-0007-03

[Abstract] Objective To construct the PSGL-1+/-;IL-2-/- mice model. Methods PSGL-1 KO mice were mated with IL-2 KO mice. Mice were genotyped by PCR after cut the tail and extracted DNA. Results After PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice for three generations, PSGL-1+/-;IL-2-/- mice were obtained. Conclusion PSGL-1+/-;IL-2-/- mice are established through PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice.

[Key words] PSGL-1;IL-2;PSGL-1 knockout mice;IL-2 knockout mice;Animal model

基因工程小鼠(genetically engineered mouse,GEM)是随着细胞工程、分子生物学的发展,利用基因打靶、转基因、嵌合体等技术对实验小鼠基因组有目的的改造或修饰,使小鼠有特定的特性或生物表型,以研究基因的功能、调控机制及与其他基因的相互作用等[1]。基因工程小鼠还可以作为人类的疾病模型,如自发肿瘤模型、自发动脉粥样硬化模型等,研究疾病的发病机制和药物研究。基因工程小鼠包括基因敲除小鼠、基因替换小鼠和转基因小鼠[2,3]。本实验所用的两种基因工程小鼠为基因敲除小鼠,分别是白细胞介素-2敲除小鼠(IL-2 KO mouse)和P-选择素糖蛋白配体-1敲除小鼠(PSGL-1 KO mouse)。为了进一步研究白细胞介素-2和P-选择素糖蛋白配体-1在炎症、心血管及肿瘤疾病中的共同作用,将IL-2 KO 小鼠和PSGL-1 KO 小鼠杂交建立了PSGL-1基因敲除及IL-2为杂合子的PSGL-1+/-;IL-2-/-小鼠模型。可以再利用此小鼠模型建立各种炎症、心血管及肿瘤等疾病模型,所以此模型可作为研究PSGL-1和IL-2在炎症、心血管和肿瘤中作用及相互关系的良好动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 实验动物及饲养 P-选择素糖蛋白配体-1敲除小鼠(PSGL-1 KO小鼠)和白介素-2敲除小鼠(IL-2 KO小鼠)购自美国Jackson实验室,共4只,雌雄各2只,周龄6~8周。小鼠在SPF级环境中饲养,动物房温度控制在22℃~28℃,湿度为50%~70%,并且保持12 h明/12 h暗。小鼠的饲料购自广东省医学实验动物中心并经60Co辐照灭菌的全营养饲料。饮用水高压灭菌。实验设计时间为2013年6月~2014年3月。

1.1.2 试剂 PCR引物由广州英骏公司合成,蛋白酶K及dNTP购自Sigma公司,Taq酶、Tris饱和酚及氯仿从广州康龙公司订购。

1.2 方法

1.2.1 IL-2基因的鉴定 突变型IL-2引物的序列:TCG AAT TCG CCA ATG ACA AGA CGC T;野生型IL-2引物的序列:CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT;通用引物序列:GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C。PCR反应条件:94℃变性3 min,94℃ 30 s,64℃ 45 s,72℃ 45 s,35个循环,72℃2 min充分延伸。在500 bp处有一条带为IL-2纯合子的小鼠,在342 bp处有一条带为野生型小鼠,在500 bp和324 bp处各有一条带为杂合子小鼠。

1.2.2 PSGL-1基因的鉴定 野生型PSGL-1基因引物序列:P1:5'-TCAAAA TC GTCATCCCCAAC -3,P2:5'-AGCTTCCTT GTGCTGCTGAC -3'';突变型PSGL-1基因引物序列:P1:5'-CCTT CTAT CGCC TTCT TGA CG-3',P2:5'-TCAAAA TCGTCA TCCCCAAC-3'。PCR反应的条件:94℃变性5 min,94℃30 s,65℃ 1 min,72℃ 1 min,循环35次;72℃延伸2 min。PSGL-1基因敲除的纯合子小鼠在500 bp处有一条带,PSGL-1基因为杂合子的小鼠在140 bp和500 bp处各有一条带。

1.2.3 PSGL-1+/-;IL-2-/-小鼠模型的构建 用IL-2 KO 雄性小鼠与PSGL-1 KO雌性小鼠杂交,第一代小鼠PSGL-1和IL-2基因均为杂合子,用PSGL-1+/-;IL-2+/-雄性小鼠与IL-2 KO雌性小鼠或者用PSGL-1+/-;IL-2+/-雌性小鼠与IL-2 KO雄性小鼠再进行杂交,在第二代可得到PSGL-1+/-;IL-2-/-小鼠。endprint

2 结果

2.1 IL-2 KO小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交情况

IL-2 KO 雄性小鼠与PSGL-1 KO雌性小鼠以1∶2的比例杂交两笼,所生小鼠IL-2和PSGL-1基因全部为杂合子,共获得24只。用第一代小鼠与IL-2 KO 小鼠杂交,第二代共获得小鼠136只,其中PSGL-1+/-;IL-2-/-小鼠38只。

2.2 PSGL-1+/-;IL-2-/-小鼠的鉴定结果

把PSGL-1 KO小鼠和IL-2 KO小鼠杂交,在第三代小鼠中,1、3号和4号小鼠为PSGL-1+/-;IL-2-/-小鼠,2号小鼠为PSGL-1+/-;IL-2+/-小鼠。图1A中的5号小鼠为PSGL-1基因的阳性对照,图1B中的5号小鼠为IL-2基因的阳性对照。

3讨论

白介素-2(IL-2)是由Morgan等在1976年发现的由T淋巴细胞分泌的一种因子,主要由活化的Ⅰ型辅助淋巴细胞分泌,主要功能是刺激T细胞的增生,促进T细胞的增殖;还促进NK细胞和B细胞的活化、增殖;促进细胞毒性T淋巴细胞的产生和增殖等[4-6]。白介素-2还可以促使NK细胞、T淋巴细胞产生肿瘤坏死因子和干扰素等,而且目前已广泛应用于抗炎和抗肿瘤治疗[7-10]。

P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)是一种粘附分子,在几乎所有类型的白细胞表面表达,是选择素的配体[11-14]。因此,PSGL-1与表达于白细胞的L-选择素及表达于活化的血管内皮细胞的E-选择素和P-选择素相互作用,从而介导白细胞的黏附[15,16]。由于白细胞黏附与炎症、凝血、伤口修复及肿瘤转移等密切相关,因此PSGL-1介导的白细胞黏附作用可在多种生理和病理过程中发挥重要的作用。

IL-2敲除小鼠是由Ivan Horak等在1991年构建成功的,IL-2纯合子敲除小鼠在4~9周时会出现脾、淋巴结肿大、肠道炎症及贫血等疾病的症状。由于白介素-2与PSGL-1在炎症、肿瘤等疾病中都发挥重要作用,为了探索两者是否具有协同或拮抗作用,本实验将白细胞介素-2敲除小鼠和黏附分子P-选择素糖蛋白配体基因敲除小鼠杂交建立了PSGL-1基因敲除及IL-2为杂合子的PSGL-1+/-;IL-2-/-小鼠模型,在饲养的过程中,由于PSGL-1+/-;IL-2-/-小鼠的免疫力会降低,易感染,因此在饲养的过程中对无菌的要求会更加严格,小鼠必须饲养于SPF环境中,饮用水及饲料必须是无菌的。可以利用此小鼠模型建立各种炎症、心血管、自身免疫性疾病及肿瘤模型,也为研究PSGL-1和IL-2在炎症、心血管和肿瘤疾病中的作用及相互关系提供了良好的动物模型。

[参考文献]

[1] Watson AL,Anderson LK,Greeley AD,et al. Co-targeting the MAPK and PI3K/AKT/mTOR pathways in two genetically engineered mouse models of schwann cell tumors reduces tumor grade and multiplicity[J]. Oncotarget, 2014,5(6):1502-1514.

[2] 宁磊,王保宁. 基因工程小鼠研究现状[J]. 青海科技,2000, 7:46-47.

[3] Nomura T. Practical development of genetically engineered animals as human disease models[J]. Lab Anim Sci,1997,47(2):113-117.

[4] Okeke EB1,Okwor I,Mou Z, et al. CD4+CD25+ regulatory T cells attenuate lipopolysaccharide-induced systemic inflammatory responses and promotes survival in murine Escherichia coli infection[J]. Shock,2013,40(1):65-73.

[5] Heemskerk B, Liu K, Dudley ME, et al. Adoptive cell therapy for patients with melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes genetically engineered to secrete interleukin-2[J]. Hum Gene Ther, 2008,19(5):496-510.

[6] Gardner PJ,Joshi L,Lee RW,et al. SIRT1 activation protects against autoimmune T cell-driven retinal disease in mice via inhibition of IL-2/Stat5 signaling[J]. J Autoimmun, 2013,42:117-129.

[7] Hao J1, Liu R, Piao W, et al. Central nervous system (CNS)-resident natural killer cells suppress Th17 responses and CNS autoimmune pathology[J]. J Exp Med, 2010,207(9):1907-1921.

[8] 徐世新, 姚舒, 陆淑凤. 重组白介素2联合卡铂胸腔内灌注治疗恶性胸腔积液临床观察[J]. 中国当代医药,2010,17(34):68-69.endprint

[9] 杨林,王金万,孙燕. 重组人新型白介素-2治疗晚期肿瘤Ⅱ期临床研究[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志,2001,8(4):277-280.

[10] 刘大勇,冀成山, 郝鸿泽. 腔内注入重组白介素-2治疗肺癌恶性心包积液30例临床观察[J]. 心肺血管病杂志,2011,30(1):75-76.

[11] Hoos A, Protsyuk D, Borsig L. Metastatic growth progression caused by PSGL-1-mediated recruitment of monocytes to metastatic sites[J]. Cancer Res, 2014,74(3):695-704.

[12] Banks JM,Herman CT,Bailey RC. Bromelain decreases neutrophil interactions with P-selectin,but not E-selectin,in vitro by proteolytic cleavage of P-selectin glycoprotein ligand-1[J]. PLoS One,2013,8(11):e78988.

[13] Stadtmann A,Germena G,Block H,et al. The PSGL-1-L-selectin signaling complex regulates neutrophil adhesion under flow[J]. J Exp Med,2013,210(11):2171-2180.

[14] Lo CY,Antonopoulos A,Dell A,et al. The use of surface immobilization of P-selectin glycoprotein ligand-1 on mesenchymal stem cells to facilitate selectin mediated cell tethering and rolling[J]. Biomaterials,2013,34(33):8213-8222.

[15] Moore KL,Stults NL,Diaz S,et al. Identification of a specific glycoprotein ligand for P-selectin(CD62)on myeloid cells[J]. J Cell Biol,1992,118(2):445-456.

[16] McEver RP,Cummings RD. Role of PSGL-1 binding to selectins in leukocyte recruitment[J]. J Clin Invest,1997, 100(11):S97-103.

(收稿日期:2014-04-14)endprint

[9] 杨林,王金万,孙燕. 重组人新型白介素-2治疗晚期肿瘤Ⅱ期临床研究[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志,2001,8(4):277-280.

[10] 刘大勇,冀成山, 郝鸿泽. 腔内注入重组白介素-2治疗肺癌恶性心包积液30例临床观察[J]. 心肺血管病杂志,2011,30(1):75-76.

[11] Hoos A, Protsyuk D, Borsig L. Metastatic growth progression caused by PSGL-1-mediated recruitment of monocytes to metastatic sites[J]. Cancer Res, 2014,74(3):695-704.

[12] Banks JM,Herman CT,Bailey RC. Bromelain decreases neutrophil interactions with P-selectin,but not E-selectin,in vitro by proteolytic cleavage of P-selectin glycoprotein ligand-1[J]. PLoS One,2013,8(11):e78988.

[13] Stadtmann A,Germena G,Block H,et al. The PSGL-1-L-selectin signaling complex regulates neutrophil adhesion under flow[J]. J Exp Med,2013,210(11):2171-2180.

[14] Lo CY,Antonopoulos A,Dell A,et al. The use of surface immobilization of P-selectin glycoprotein ligand-1 on mesenchymal stem cells to facilitate selectin mediated cell tethering and rolling[J]. Biomaterials,2013,34(33):8213-8222.

[15] Moore KL,Stults NL,Diaz S,et al. Identification of a specific glycoprotein ligand for P-selectin(CD62)on myeloid cells[J]. J Cell Biol,1992,118(2):445-456.

[16] McEver RP,Cummings RD. Role of PSGL-1 binding to selectins in leukocyte recruitment[J]. J Clin Invest,1997, 100(11):S97-103.

(收稿日期:2014-04-14)endprint

[9] 杨林,王金万,孙燕. 重组人新型白介素-2治疗晚期肿瘤Ⅱ期临床研究[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志,2001,8(4):277-280.

[10] 刘大勇,冀成山, 郝鸿泽. 腔内注入重组白介素-2治疗肺癌恶性心包积液30例临床观察[J]. 心肺血管病杂志,2011,30(1):75-76.

[11] Hoos A, Protsyuk D, Borsig L. Metastatic growth progression caused by PSGL-1-mediated recruitment of monocytes to metastatic sites[J]. Cancer Res, 2014,74(3):695-704.

[12] Banks JM,Herman CT,Bailey RC. Bromelain decreases neutrophil interactions with P-selectin,but not E-selectin,in vitro by proteolytic cleavage of P-selectin glycoprotein ligand-1[J]. PLoS One,2013,8(11):e78988.

[13] Stadtmann A,Germena G,Block H,et al. The PSGL-1-L-selectin signaling complex regulates neutrophil adhesion under flow[J]. J Exp Med,2013,210(11):2171-2180.

[14] Lo CY,Antonopoulos A,Dell A,et al. The use of surface immobilization of P-selectin glycoprotein ligand-1 on mesenchymal stem cells to facilitate selectin mediated cell tethering and rolling[J]. Biomaterials,2013,34(33):8213-8222.

[15] Moore KL,Stults NL,Diaz S,et al. Identification of a specific glycoprotein ligand for P-selectin(CD62)on myeloid cells[J]. J Cell Biol,1992,118(2):445-456.

[16] McEver RP,Cummings RD. Role of PSGL-1 binding to selectins in leukocyte recruitment[J]. J Clin Invest,1997, 100(11):S97-103.

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