吴 丹

(江苏省无锡市第二人民医院 心内科, 江苏 无锡, 214002)

已有许多研究[1]提示了中枢内血管紧张素Ⅱ对心衰发展可能的促进作用。而SD大鼠脑片膜片钳的研究，进一步揭示了通过血管紧张素作用于AT1型受体进而影响到下丘脑神经元细胞的兴奋性的离子机制[2]。本实验探讨PVN内AT1-R的蛋白表达变化情况，以期进一步证实中枢内包括血管紧张素Ⅱ及AT1-R介导的对于心衰可能的促进作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Spreague-Dawley(SD)大鼠。体质量(200±20) g。购自南通大学实验动物中心。实验动物合格证号：2082871。

1.2 主要试剂

水合氯醛、α-氯醛糖、羊抗兔IgG FITC 荧光二抗、Triton X-100、多聚甲醛、Hoechst33342: Sigma、二抗(goat anti-rabbit IgG-HRP): Santa Cruz; 抗AT1-R一抗: abcam; Tris 三(羟甲基)氨基甲烷：上海生工、青霉素：华北制药厂; RIPA裂解液、PMSF(100mM)、BCA蛋白浓度测定试剂盒、5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)、抗荧光淬灭封片液、彩色预染蛋白质分子量标准、PVDF膜(进口分装)、Actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)：海门碧云天；无水乙醇、甲醇：国药集团化学试剂有限公司、盐酸：汕头市西陇化工厂有限公司、氢氧化钠：南京化学试剂有限公司；AP(过硫酸铵)、SDS(十二烷基磺酸钠)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tween-20、L-甘氨酸、TEMED(N, N, N′,N′-四甲基二乙胺) ：合肥博美生物科技有限责任公司。

1.3 主要仪器

ALC-V8动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)，VIVID-7 型彩色多普勒超声诊断仪(美国GE公司)，JY10001型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，超低温冰箱(日本SANYO), BCD-254型冰箱(德国SIEMENS)，Eppendorf5417R冷冻离心机(德国)，101AB-2型电热恒温干燥箱(江苏海门恒昌仪器厂)，DK-8A电热恒温水槽(上海华联环境试验设备公司恒昌仪器厂), Synergy-2多功能酶标仪(Biotek)，CM-1900UV冷冻切片机(Leica), DM4000B研究级正置荧光显微镜(Leica)，基础电泳仪(BioRad)，小型垂直电泳槽(BioRad)，小型转膜槽(BioRad)，超高灵敏度化学发光成像系统(ChemiDocXRS+)(BioRad)。

1.4 心衰大鼠模型制作与分组

将20只健康雄性清洁级SD大鼠随机分为手术组10只与假手术组10只。用结扎大鼠冠脉左前降支(LAD)的方法构建慢性心力衰竭大鼠模型。术后6周，2组大鼠采用VIVID-7 型彩色多普勒超声诊断仪测量二维超声心动图，对大鼠心脏进行扫查。采用EF值<42%作为评定心力衰竭的诊断标准[5]。所有大鼠术后6周即行处死、取材，备以下实验所用。Western Blot技术(随机抽取5只心衰及5只假手术组)或免疫荧光技术的检测(随机抽取5只心衰及5只假手术组)。通过 Western Blot技术检测室旁核内AT1-R的表达情况。大鼠断头，迅速取出脑，转移至液氮中，随后储存在-70 ℃的条件下，迅速从冰箱中取出冰冻的脑，用冰冻切片机切片。切片厚度：300 m(60 m×5)。在冰上操作，用穿孔器，根据大鼠脑定位图谱(Watson & Paxinos)，在1 mm厚(距前囟点-0.84 mm～-2.28 mm)的双侧脑片的PVN所在区域，打孔，提取PVN至Eppendorf管中。再进行蛋白质抽提、蛋白定量，配制10%的SDS-PAGE分离胶、配制5%的浓缩胶、灌胶、电泳、转膜、封闭及加入抗体孵育、显影、使用Quantity One软件分别测定目的蛋白及相应内参条带的面积和灰度值的乘积，进而计算上述两者面积和灰度值乘积的比值，来表示蛋白的表达水平。使用免疫荧光技术检测AT1-R的免疫组织化学表达情况。大鼠麻醉后行心脏多聚甲醛灌注，取脑后行冰冻切片，每只大鼠取20张PVN脑片，选取5个冠状位切面观测AT1-R阳性神经元分布情况，并作阴性对照。将脑片贴片后，用AT1-R的一抗保湿孵育，漂洗后，使用羊抗兔IgG-FITC(二抗)保湿避光孵育并漂洗。使用核染色剂Hoechst33342标记细胞核。保湿避光孵育后漂洗。封片后使用荧光正置显微镜镜检。观测5个冠状位切面脑片上AT1-R阳性神经元的分布及数量，并作统计。用物镜40倍分别拍片。每张脑片在物镜40倍下，随机取4个PVN视野，计数阳性神经元数量的总和，比较心衰与假手术组AT1-R三种蛋白之间的表达差异。

1.5 统计学方法

实验数据均为计量资料，采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。使用两独立样本均数的t-检验来进行统计学分析，所有结果用平均值±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

心衰组与假手术组心超测定的EF值比较，心衰组大鼠的左心室收缩期内径(LVIDs)、射血分数(EF%)及短轴缩短率(FS%)较假手术组明显降低。见表1。

表1 2组大鼠心超结果比较

与假手术组比较，*P<0.05。

Western Blot技术检测室旁核内AT1-R的表达情况显示，心衰组室旁核内的AT1-R表达明显高于假手术组[(1.69±0.85)、(0.49±0.31),P<0.05], 差异有统计学意义。见图1、表2。

表2 2组Western Blot检测室旁核内AT1-R结果

免疫荧光技术检测室旁核内AT1-R的表达情况显示，心衰组室旁核内的AT1-R表达明显高于假手术组[分别为(821.00±79.25)、(466.40±68.86)，P<0.05], 差异有统计学意义。见图2、表3。

表3 2组免疫荧光技术检测室旁核内AT1-R结果

3 讨 论

作者采用Western blot 及免疫荧光的方法所获得的实验结果表明，心梗后心衰SD大鼠PVN中血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1-R)的蛋白表达及分布密度比假手术组明显增加。与他人的研究结果，即心梗后AT1-R及血管紧缩素转化酶(ACE)的mRNA、蛋白表达水平在穹隆下器(SFO)、PVN等神经核团中明显增加[3-4]相一致。提示血管紧张素Ⅱ通过中枢内AT1-R介导的机制影响心衰的进程。有研究[2,5-6]证实中枢血管紧张素Ⅱ可促进心室重构而加重心衰。上述通路可活化血管紧张素能通路并进一步提高交感神经活性，而促进心衰的发展。由于血管紧张素Ⅱ可通过激活血管紧张素Ⅱ1型受体及介导多种阳离子电流的离子通道，兴奋支配延髓头端腹外侧(RVLM)的PVN神经元[7], 因此作者推测中枢血管紧张素Ⅱ通过具有投射至脑干心血管调控中枢(延髓头端腹外侧核, RVLM)的纤维的PVN神经元表达的AT1-R，来影响交感神经冲动外流进而促进心衰进展。

[1] Westcott K V, Huang B S, Leenen F H. Brain renin-angiotensin-aldosterone system and ventricular remodeling after myocardial infarct: a review[J]. Can J Physiol Pharmacol, 2009, 87(12): 979.

[2] Li Z, Ferguson A V. Electrophysiological properties of paraventricular magnocellular neurons in rat brain slices: modulation of IA by angiotensin II[J]. Neuroscience, 1996, 71(1): 133.

[3] Tan J, Wang H, Leenen, F H. Increases in brain and cardiac AT1 receptor and ACE densities after myocardial infarct in rats[J]. Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol, 2004, 286(5): H1665.

[4] Yu Y, Wei S G, Zhang Z H, et al. Does aldosterone upregulate the brain renin-angiotension system in rats with heart failure[J]. Hypertension, 2008, 51(3): 727.

[5] Leenen F H H, Huang B S, Yu H, et al. Brain′ouabain′mediates sympathetic hyperactivity in congestive heart failure[J]. Circ Res, 1995, 77(5): 993.

[6] Huang B S, Ahmad M, Tan J, et al. Sympathetic hyperactivity and cardiac dysfunction post-MI:different impact of specific CNS versus general AT1 receptor blockade[J]. J Mol Cell Cardiol, 2007, 43(4): 479.

[7] Cato M J, Toney G M. Angiotensin Ⅱ excites paraventricular nucleus neurons that innervate the rostral ventrolateral medulla an in vitro patch-clamp study in brain slices[J]. J Neurophysiol, 2005, 93(1): 403.