陈思礼，龚凤娇，田 申

(中南民族大学 生命科学学院， 武汉 430074)

在鱼腥藻PCC7120中，铁元素的代谢途径由基因fur(furric uptake regulator)编码的铁吸收调节蛋白Fur调控.PCC7120基因组中有3种同源Fur基因,分别编码3种蛋白：FurA, FurB和FurC. FurC不与启动子结合，而是通过影响前两种蛋白与DNA靶位点结合的能力[1]，从转录水平调节与铁代谢相关基因的表达[2].Fur是典型的负调控因子.当亚铁离子富足时，为避免过量金属对细胞产生毒性，Fur与亚铁离子结合成聚合物，占据调控区域，阻遏该基因表达；当亚铁离子贫乏时，未结合到亚铁离子的Fur蛋白不能顺利结合到DNA调控序列，则相关的基因表达开启.此外，Fur还对异形胞分化，转录调节和氧化还原平衡等功能相关的基因有重叠调控作用[3]，还能抵御氧化胁迫和其它环境胁迫[4].

此次研究克隆出鱼腥藻PCC7120FurC基因(alr0957)，成功构建表达载体pET-fur,并在大肠杆菌BL21中表达出了带有组氨酸标签的融合蛋白，并通过设计不同Fe3+浓度梯度，探讨不同铁离子浓度对藻类生长的影响,为进一步该蛋白研究奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 藻种和细菌菌株

鱼腥藻Anabaenasp.PCC 7120购于中科院水生生物研究所淡水藻种库(FACHB).大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)均为本实验室保藏菌种.

1.2 载体质粒及其他试剂

pET-28a(+)载体为本实验室构建并保存，pMD18-T载体(Takara公司)，DNA聚合酶(Fermentas公司)，限制性内切酶、T4 DNA连接酶(Takara公司)，琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒(Axygene公司)， PCR引物合成和基因序列测定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成.

1.3 基因组DNA提取

PCC7120基因组DNA提取对传统酚氯仿作了改进.离心收集对数期藻细胞，无菌水清洗1次，重悬于100 mmol/L EDTA(pH 8.0)，80 μL 50 mg/mL溶菌酶至终浓度2 mg/mL，37 ℃水浴约37 min，置于-20 ℃冰柜冷藏约30 min，反复数次直至溶液呈蓝绿色.加入SDS至终浓度1.5%，60 ℃水浴10 min至溶液变黄以充分裂解.再利用酚氯仿法对DNA进一步分离纯化.严格按照分子生物学标准方法进行操作[5].

1.4 引物设计与基因克隆

为便于克隆，在引物F1:5′-CGGGATCCTATGCAGCAACAGGCAATATC-3′和R1:5′-CCCAAGCTTCTACTCTTCATCTTGAGGATGC-3′中分别添加BamH I和Hind III酶切位点.PCR反应体系中含2.5μL 10×Taq buffer，引物各1μL，1μL dNTPs，2μL模板DNA，1μL DNA聚合酶，ddH2O补足到25 μL.PCR反应程序如下： 95 ℃预变性5 min； 95 ℃变性40 s，65 ℃～50 ℃复性40 s(每循环下降0.5 ℃)，72 ℃延伸1 min，30个循环；95 ℃变性40 s， 50 ℃退火40 s，72℃延伸1 min， 15个循环；72 ℃延伸10 min.DNA凝胶回收层析柱纯化回收目的片段.与载体pMD18-T连接过夜，转化E.coliDH5α，转化子涂布于含氨苄青霉素LB平板上，并用蓝白斑筛选阳性克隆.经菌液PCR、质粒提取、双酶切等初步鉴定，送测序通过序列比对得以确定.

1.5 重组表达载体的构建

测序正确后，分别对pMD18-T-fur、pET-28a(+)提质粒，并由双酶切、回收目的片段在T4 DNA连接酶的作用下连接，转化到E.coliBL21感受态细胞中，涂布于卡那抗性LB平板上，筛选阳性克隆，送测序以确定.

1.6 重组蛋白的体外表达

将含pET-fur的重组菌BL21接种于含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养约3 h至OD600≈0.5，加入1 mmol/L的IPTG于37℃下摇床培养18 h，诱导目的蛋白表达.离心收集沉淀，加入2×SDS凝胶缓冲液和还原性保护剂β-巯基乙醇，沸水浴5 min，离心取上清，用SDS-PAGE电泳检测外源蛋白质的分子量.

1.7 蛋白的纯化

用镍柱层析纯化pET系列载体表达产物.IPTG诱导后离心收集菌体，用Binding Buffer(BB)溶解，超声裂解30 min后离心去除杂质，取上清，离心后得包涵体.用含尿素的BB洗包涵体，将上清溶解液上柱，平衡柱子后进行柱层析，分管收集，每管2 mL.

1.8 Fe3+对鱼腥藻生长的影响

1.8.1 藻生长密度的测定

配制200 mL培养基，每个浓度设3个平行样品(配方略).接种10 mL对数期Anabaenasp.PCC 7120藻培养液至培养基中，使初始浓度在OD730≈0.5.接种好的藻液在25℃光照培养箱中静置培养，设置培养箱光照强度为2000 lux、光暗比为14 h︰10 h，每日轻轻震荡数次，从次日起，每天同一时间测定OD730，观察其生长情况.以生理盐水为参比溶液，测定鱼腥藻Anabaenasp.PCC 7120生长曲线.每个浓度的测量最终值取3个平行样品的均值.

1.8.2 叶绿素含量的测定

取10 mL藻细胞培养液，用0.45μm微孔滤膜抽滤，转移藻细胞至研钵中，加入6 mL 90%乙醇溶液，冰上充分研磨，将研磨液转入刻度试管中，4 ℃静置12 h进行暗反应， 4000 r/min离心15 min；转移上清至10 mL试管，向沉淀中加4 mL 90 %乙醇，静置1h后再4000 r/min离心15 min，合并两次提取的上清.以90 %乙醇作参比，在波长664 nm下测吸光度值，取每组平均值.计算叶绿素含量的公式为[6]：叶绿素浓度(mg/L)=(OD664×1000)/34.5。

1.8.3 蒽酮比色法测定总糖含量

制作葡萄糖标准曲线，620 nm比色得到葡萄糖标准曲线的公式(y=1.0093x-0.0177,y为蒽酮比色法测得的OD620，如表1).离心管收集培养至第7天的藻液，4 ℃ 9000 r/min离心10 min，弃上清，加入0.5 mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲液3 mL悬浮洗涤沉淀，4 ℃ 9000 r/min离心5 min，重复一次.菌体重悬于5 mL预冷的超声破碎细胞缓冲液中充分破碎细胞，取1 mL细胞破碎液，加4 mL蒽酮试剂混合均匀，沸水中煮沸10 min，取出后流水冷却，室温放置10 min，使之显色稳定，620 nm比色.根据测得OD620值，由葡萄糖标准曲线的公式计算藻的糖含量.

表1 葡萄糖标准溶液稀释梯度

2 结果

2.1 FurC(alr0957)基因的克隆

用touchdown PCR的方法从鱼腥藻Anabaenasp.PCC 7120基因组DNA中成功扩增得到450 bp的目的片段，如图1所示.将目的片段连接到pMD18-T载体上，再进行转化和重组子筛选.经鉴定测序，证明成功克隆了FurC基因.通过序列分析比对，可知该基因含有450 bp的开放阅读框，编码149个氨基酸，其相对分子量为17380.

M：DNA Marker 2000；1～3) PCR产物图1 PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoresis identification of PCR product

2.2 重组表达载体pET-Fur的构建与鉴定

pMD-Fur经过BamH I/Hind III双酶切后，与pET-28a(+)相连接，转化表达菌株BL21，筛选阳性表达质粒.通过PCR、酶切初步鉴定均成阳性.经测序与NCBI公布的序列完全一致，说明成功构建了pET-Fur. IPTG对其在体外进行诱导表达.

2.3 融合蛋白的表达检测及纯化

样品经超声破碎并离心后，分别对上清和沉淀作SDS-PAGE电泳检测，结果表明：表达出的蛋白可溶性较低，大部分存在于离心后的沉淀部分，因为目的蛋白位于破碎的细胞膜上或产生了包涵体，在上清中浓度很低.FurC含17328个氨基酸，由于pET-FurC所表达的融合蛋白其N端带有T7-tag的11个氨基酸残基序列MASMTGGQQMG和1个多聚组氨酸标签，故预测该融合蛋白大小约为19 kD.如图2所示，融合蛋白pET-Fur获得了成功表达.经过一系列蛋白表达条件的优化，基本满足蛋白纯化的条件，利用镍柱层析法纯化FurC.

M：蛋白质分子量标准；1) 普通菌株BL21；2) 含pET-28 a (+)空载体的BL21；3) 未诱导的重组质粒pET-Fur；4) 经0.5 mmol/L IPTG诱导的重组质粒；5) 经1 mmol/L IPTG诱导的重组质粒图2 重组蛋白pET-Fur的SDS-PAGE检测 Fig.2 The SDS-PAGE assay of expressed pET-Fur

2.4 Fe3+对鱼腥藻生长的影响

通过设计不同Fe3+浓度对鱼腥藻PCC7120的生长影响实验，研究藻细胞在生长过程中叶绿素和可溶性糖含量的变化，结果见图3.图3a中不同浓度的Fe3+影响下，PCC7120生长速率有较明显差异.在0.1 ～0.5 mg/L时低浓度Fe3+对鱼腥藻PCC 7120的生长有较明显的促进作用，藻的生长在第3天出现转折点，斜率增加进入对数期，且Fe3+浓度越高，藻的生长状况越好，0.5 mg/L浓度为适合生长浓度.当Fe3+浓度大于0.9 mg/L时，随浓度的升高，藻的生长速率逐渐减慢，生长量减少；当Fe3+浓度为4.0 mg/L时，藻的生长率与低浓度Fe3+藻培养液相比，生长速率明显低于后者，甚至低于缺铁组，7d后生长量依然最低，故高浓度的铁对其生长有明显的抑制作用.

a～c)不同Fe3+浓度下PCC 7120生长曲线、叶绿素a含量和可溶性糖含量图3 不同Fe3+浓度下鱼腥藻Anabaena sp. PCC 7120生长指标的变化 Fig.3 Growth index changes in Anabaena sp.PCC 7120 treated with different concentrations of Fe3+

图3b中，当Fe3+浓度小于 0.5 mg/L，随Fe3+浓度的增加，叶绿素含量递增；但当Fe3+浓度大于0.9 mg/L时，铁离子对叶绿素a的合成受到了高浓度铁的胁迫作用，此时叶绿素a含量随着Fe3+浓度的增大而减少，与藻培养液颜色变化一致. 图3c中， Fe3+浓度梯度对糖含量影响与生长趋势和叶绿素a含量的变化非常类似.由于Fe是糖分解、合成代谢途径中的功能蛋白(如异柠檬酸脱氢酶)的重要组分，故糖含量在低Fe3+时随其浓度升高而增加，一旦超出需要的范围，则糖合成代谢被抑制，表现为随Fe3+浓度增加而递减.

3 讨论

目前证实在E.coli中，Fur基因控制90多种铁依赖性基因的表达，包括降解/合成铁载体的有关的酶类、铁载体受体、调控蛋白、膜载体、金属还原酶等基因[7].而Fur蛋白调节细胞内铁的生理代谢过程.

本文成功地将鱼腥藻PCC7120的alr0957(FurC)基因克隆并构建到表达载体pET-28a(+)上得到重组质粒pET-Fur，在37℃下经1 mmol/L诱导18 h，成功表达了融合蛋白，表达产物的SDS-PAGE电泳检测图与预期一致，大小约19 KD.通过优化表达条件实现了FurC蛋白的纯化，为FurC基因的功能进一步研究奠定了基础.

铁是藻类生长代谢的必需元素，但铁浓度过高又会导致藻细胞渗透性增加，甚至引起藻类形态的变异[8].不同Fe3+浓度影响鱼腥藻Anabaenasp. PCC7120的生长，其生长量和生长速率、叶绿素a含量、可溶性糖含量随Fe3+浓度变化先增后减，说明低浓度铁对藻的生长起促进作用，而超过一定浓度(本实验为0.9 mg/L)则为抑制作用.故治理藻类污染时，除了要注意控制氮、磷等大量元素外，还要考虑铁等微量元素的调控作用.

参 考 文 献

[1] Hernández J A, López-Gomollón S, Bes M T, et al. Three fur homologues from Anabaena sp. PCC7120: exploring reciprocal protein-promoter recognition[J]. FEMS Microbiol Lett, 2004, 236(2):275-282.

[2] 李俊峰.有益菌A18菌株铁载体的研究和铁吸收调节蛋白(Fur)基因的克隆和表达[D].青岛：中国海洋大学, 2005.

[3] López-Gomollón S, Hernóndez J A, Pellicer S, et al. Cross-talk between iron and nitrogen regulatory networks in anabaena(Nostoc)sp.PCC 7120: identification of overlapping genes in FurA and NtcA regulons[J]. J Mol Biol, 2007,3741(1):267-281.

[5] 萨姆布鲁克J, 拉塞尔D W.分子克隆实验指南精编版[M].黄培堂,王恒木梁，周晓巍，等译.北京:化学工业出版社,2007.

[6] 张丽彬, 王启山, 徐新惠, 等.乙醇法测定浮游植物叶绿素a含量的讨论[J].中国环境监测, 2008, 24(6):9-10.

[7] Hantke K. Members of the Fur protein family regulate iron and zinc transport inE.coliand characteristics of the Fur-regulated fhuF protein [J]. J Mol Microbiol Biotechnol, 2002, 4(3):217-222.

[8] 刘晓海, 高云涛, 杜 刚, 等.铁离子对滇池藻类生长的影响[J].环境污染与防治, 2006, 28(5):324-326.