吴 珍，陈凤娥

（商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西商洛726000）

商麦5226灌浆期旗叶酯酶同工酶的研究

吴 珍，陈凤娥

（商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西商洛726000）

以商洛市不同种植区的商麦5226为材料，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对商麦5226灌浆期旗叶酯酶同工酶进行电泳分析。结果显示：不同种植区商麦5226灌浆期旗叶共电泳出16条EST同工酶酶谱带，其中，EST1-a、EST1-b、EST1-c、EST2-e、EST2-g、EST2-j是商麦5226稳定的特征谱带，可作为鉴别商麦5226的同工酶特征图谱；商洛北部区域种植的商麦5226灌浆期旗叶EST同工酶条带数在海拔较高种植区域相对较多，不同种植区商麦5226灌浆期旗叶酯酶同工酶均具有明显的多态性，显示商麦5226具有较强的适应性。

同工酶；商麦5226；旗叶；电泳

由于商洛地形、地貌复杂，气候条件多样[1],形成了丰富的物种资源,小麦经过不同生态区漫长的自然和人工选择,已适应其所存在的环境条件,形成复杂多样的遗传特性，不同品种间形成明显差异[2-3]。同工酶是基因编码的产物，能较好地反映物种间的遗传差异，常被用于物种的分类、鉴定和亲缘关系研究[4]。植物在逆境环境下（温度、海拔等）为适应环境可以诱导合成新的蛋白，基因表达产生新的蛋白行使相同的功能，其同工酶酶谱发生变化。酯酶同工酶（EST）是一组能水解酯键的酶,存在于植物各部位和不同发育时期的细胞中,酯酶一般被作为研究发育时期基因表达调控的一种标志酶[5]。酯酶同工酶分析研究在植物研究中都有很广泛的应用，酯酶同工酶也成为小麦种质资源及其遗传多样性研究的很好素材，近年来有学者对小麦、玉米等农作物进行同工酶的研究。兰秀锦等分析了多倍体品种的酯酶同工酶酶谱的差异[6],牛国阳等分析研究了几种小麦雄性不育系及其保持系与恢复系在旗叶和幼小穗的酯酶同工酶的差异[7]，关于商洛选育的小麦品种酯酶同工酶方面的研究未见报道，本研究旨在通过对商麦5226进行酯酶同工酶电泳分析,以探讨其遗传多样性,为今后小麦的品种选育和适宜种植区的筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为商洛不同区域种植的商麦5226（由商洛学院生物医药与食品工程学院实验室培育），每地随机选取10株小麦，在灌浆期剪下小麦的旗叶，将10株小麦的旗叶混合装入自封袋中密封，于冰盒中带回实验室置0℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 酯酶的提取

取各样品旗叶清洗干净自然晾干，各取1 g放入预冷过的研钵中，加入2倍体积的电极缓冲液(Tris-甘氨酸，pH8.3)及适量石英砂，冰浴研磨成匀浆，3000 rpm离心20 min，上清液即为粗酶提取液，分别装入试剂瓶标上标签贮于4℃冰箱中备用。

1.2.2 电泳及染色

电泳：采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法，上样酶量30 μL，在浓缩胶（浓度为4%）里稳流20 mA，进入分离胶（浓度为8%）后稳流40 mA，待溴酚蓝行至距分离胶边缘约1 cm处时，停止电泳。

酯酶同工酶(EST)染色：染色法参照胡书能等[8]方法稍加改进，取100 mg坚牢蓝RR盐、50 mg α-醋酸萘酯和50 mg β-醋酸萘酯用10 mL丙酮溶解，再加入90 mL的0.1 mol·L-1pH6.5磷酸缓冲液摇匀，待溶液为砖色便可以使用，现配现用，待出现清晰酶带时即可停止染色,保存在7%的醋酸溶液里，用胶片观察灯对酶谱进行观察、比较和记录,然后照相。

1.2.3 实验数据处理

绘酶谱图并计算相对迁移率(Rf)值和同工酶酶谱间相似系数，Rf=酶带迁移距离/溴酚蓝迁移距离[9]，酯酶谱间相似系数计算[10]：计算公式c= 2w/(a+b)，其中c为酶谱间相似系数，w为A和B两个分类群相同的酶带数，a为分类群A在酶谱中的酶带数，b为分类群B在酶谱中的酶带数。

2 结果与分析

2.1 酯酶同工酶酶带谱分析

由图1和图2及表1可以看出，7个不同种植区商麦5226的旗叶共电泳出16条谱带，镇安、柞水谱带数量最少为9条，商州、丹凤、山阳最多为15条带。对7个不同种植区商麦5226酯酶同工酶酶谱进行分析可知，谱带共分为3个区，即：1区（0-0.182）、2区（0.182-0.545）和3区（0.545-0.727），3个主带区共有16条谱带，拟解释为3个基因位点、16个等位基因（表1），其中EST1包括EST1-a、EST1-b、EST1-c、EST1-d 4个等位基因，EST2包括EST2-a、EST2-b、EST2-c、EST2-d、EST2-e、EST2-f、EST2-g、EST2-h、EST2-i、EST2-j10个等位基因，EST3包括EST3-a、EST3-b2个等位基因，其中EST1-a、EST1-b、EST1-c、EST2-e、EST2-g、EST2-j是7个不同种植区域所有样品中均含有的谱带，为商麦5226EST同工酶谱中稳定的特征谱带，可作为鉴别商麦5226酯酶特征谱带。

图1 不同种植区商麦5226酯酶同工酶凝胶电泳图谱

图2 不同种植区商麦5226酯酶同工酶模式图谱

表1 不同种植区商麦5226酯酶同工酶酶谱Rf值

2.2 酯酶同工酶多态性及活性分析

由表2可以看出，商洛不同种植区商麦5226酯酶同工酶具有较明显的多态性，各种植地酯酶同工酶多态性位点的比例均大于56.25%，其中商州、丹凤种植地样品中酯酶同工酶多态性位点最多。由图1和图2还可以看出，除镇安（700 m）条带数较少外，海拔较高的种植区（洛南789 m，商州704 m，丹凤680 m，山阳684 m）样品酶带数相对较多，商州、丹凤、山阳的强带谱最多，而海拔低的种植区（商南670 m，柞水650 m）酶带数相对较少且染色相对较浅，综合表明这些高海拔种植区的小麦由于环境因素而促进了酯酶同工酶基因的表达，因而同工酶种类和表达量都多，其较强的适应性与酯酶的表达有一定的相关性。

表2 不同种植区商麦5226酯酶同工酶多态位点比例

2.3 酯酶同工酶相似性分析

从表3可知，不同种植区商麦5226的酯酶同工酶酶谱间相似系数变化较大，相似系数为0.571-1，其中商州、丹凤、山阳三者之间以及镇安与柞水间的相似系数最高为1，洛南与商州、丹凤、山阳间相似系数为0.929，洛南与镇安、柞水间都为0.818，商南与商州、丹凤、山阳三种植区域间均为0.815，镇安、柞水与商州、丹凤、山阳间均为0.750，而商南与镇安、柞水间最低为0.571，对于同一品种商麦5226，不同种植区小麦旗叶酯酶酶谱间出现如此大的差异可能与不同地区进入灌浆期时间早晚有关，成熟较早导致其旗叶酯酶表达量相应减少，镇安、柞水两种植区间的相似系数为1，这与两县所处的地理位置与气候大致相同有关。

以相似系数为0.850-1表示正常适应，相似系数为0.700-0.850表示适应性较好，不同种植区的酯酶同工酶中只有商州、丹凤、山阳三者之间以及镇安与柞水间的相似系数为1，洛南与商州、丹凤、山阳间相似系数为0.929为正常适应，其他均表现较高的适应性，这也表明酯酶同工酶在环境变化时能较快调整基因表达水平，使得同工酶的种类和表达量具有提高，以适应环境的变化和逆境的胁迫。

表3 不同种植区商麦5226的EST酶谱间相似系数

3 结论与讨论

同工酶几乎存在于所有生物中，在遗传上，当一种酶同时受几个基因控制时，更容易适应环境的变化。一个基因由于突变而无用时，其他基因的存在仍然可以产生类似作用的同工酶，这有助于机体适应突变的不利后果，从而帮助植物适应不同变化的环境。

从不同种植区商麦5226灌浆期旗叶酯酶同工酶酶谱结果看，商洛市六县一区的商麦5226酯酶同工酶酶谱与一定范围内海拔有关，位于海拔高的种植区（洛南789 m，商州704 m，丹凤680 m，山阳684 m）酶带数相对较多，而对于海拔低的种植区（商南670 m，柞水650 m）酶带数相对较少，原因可能是由于随着海拔的升高，温度降低，紫外线照射变强，植物体内的水分平衡被破坏，为了适应环境酯酶同工酶基因表达新的蛋白从而使得酯酶图谱发生变化。

商洛市六县一区不同种植区域的商麦5226酯酶同工酶酶谱均表现出一定的差异性，共电泳出16条EST同工酶酶带，其中EST1-a、EST1-b、EST1-c、EST2-e、EST2-g、EST2-j为商洛市七个不同种植区域商麦5226酯酶同工酶均含有的共同酶带，是商麦5226酯酶同工酶稳定的特征谱带，可作为鉴别商麦5226的酯酶同工酶特征酶谱。

[1]吴 珍,王新军,张晓虎,等.商洛山区土壤状况与适种中药材研究[J].水土保持通报,2005,25(5)：63-65.

[2]陈雪燕,王亚娟,雒景吾,等.陕西省小麦地方品种主要性状的遗传多样性研究[J].麦类作物学报,2007,27(3)：456-460.

[3]王 敏，王一峰.表观遗传修饰在植物逆境胁迫响应中的作用[J].生命科学,2013,25(6)：574-578.

[4]牛红军,李 杨.同工酶技术及其优化[J].生物学通报, 2014,49(5)：11-13.

[5]高秀琴,兰进好,穆 平.小麦遗传多样性研究进展[J].山东农业科学,2011,30(6)：33-35.

[6]兰秀锦,郑有良,刘登才,等.四川四倍体小麦地方品种酯酶同工酶[J].四川农业大学学报,2003,21(2)：88-90.

[7]牛国阳,陈庆富.几种小麦雄性不育系及其保持系、恢复系的酯酶同工酶比较[J].麦类作物学报,2012,32(4)：660-665.

[8]胡书能,万贤国.同工酶技术及其应用[M].长沙：湖南科学技术出版社,1985：70-74.

[9]黄渺鸿,杜克斌,许 林,等.杨树亲-子代叶片的过氧化物酶同工酶分析[J].湖北林业科技，2008,154(6)：1-7.

[10]魏益宁.毛白杨叶片过氧化物酶活性及同工酶谱带的研究[J].北京林学院学报,1984,6(3)：73-92.

（责任编辑：李堆淑）

Studies on the Esterase Isozymes in Flag Leaf at Grain Filling Stage of Shangmai 5226

WU Zhen,CHEN Feng-e
（College of Biopharmaceutical and Food Engineering,Shangluo University,Shangluo 726000,Shaanxi)

In order to study the growth conditions of the wheats of Shangluo 5226 in different growing areas,we study the physiological indicators of flag leaf at grain filling stage of 5226,which is a new variety of wheat and picked in six counties and one district of Shangluo.The results show that：16 bands of Esterase isozyme were detected in flag leaf of Shanamai5226 at filling stage in different locations,while EST1-a,EST1-b,EST1-c,EST2-e,EST2-g and EST2-j were the stable characteristic bands in Shangmai 5226,which can be used as the isozyme fingerprint map to itself.Bands of isozyme in flag leaf was higher in high altitude regions in northern area of Shangluo,obvious pleiomorphism existed among flag leaf in different lacations which showed Shangmai 5226 has a high adaptability.

isozyme;Shangmai 5226;flag leaf;electrophoresis

S512.1

：A

：1674-0033（2014）06-0057-04

10.13440/j.slxy.1674-0033.2014.06.017

2014-10-23

陕西省教育厅产业化培育项目（2010JC0T）

吴 珍，女，广西平南人，硕士，副教授