杨红霞， 张惠娟， 高津旭， 刘 崴， 李 冰

(1.国家地质实验测试中心， 北京 100037； 2.南京农业大学资源与环境科学学院， 江苏 南京 230026)

胁迫时间和胁迫浓度对超积累植物印度芥菜细胞中镉分布的影响

杨红霞1， 张惠娟2， 高津旭1， 刘 崴1， 李 冰1

(1.国家地质实验测试中心， 北京 100037； 2.南京农业大学资源与环境科学学院， 江苏 南京 230026)

超积累植物对重金属的区隔化作用能有效降低细胞质内金属离子的浓度，是对重金属重要的解毒机制之一，而细胞内各组织的区隔化作用大小并未取得一致性结论。本文研究了胁迫浓度和胁迫时间对超积累植物印度芥菜(Brassicajuncea)细胞及亚细胞中镉分布的影响。印度芥菜幼苗分别用0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L镉胁迫1、5、7、10、14天后收获，采用电感耦合等离子体质谱法测定印度芥菜根系和叶片亚细胞中镉的含量。结果表明：镉在细胞壁中的比例占50%～64%，细胞液占22%～38%，细胞器占7%～17%，镉在细胞壁中所占比例显著高于细胞液和细胞器，证明细胞壁区隔化在镉的解毒机制中具有重要的作用。随着胁迫时间和胁迫浓度的增加，根系和叶片中亚细胞各组织中镉含量持续增加，超过7天，镉含量显著升高，说明镉对植物的危害是一个缓慢过程。印度芥菜对镉胁迫浓度的最大耐受量为1.0 mg/L，超过此浓度，植物细胞的破坏症状加重；细胞超微结构研究也表明，镉胁迫浓度超过1.0 mg/L后，细胞结构发生了不同程度的损坏，出现质壁分离、液泡增大甚至空泡化、质膜粗糙等现象，继而影响到细胞的正常功能。因此，在考察重金属对植物的危害时，要充分考虑时间和浓度梯度两个参数的协同作用。

镉； 亚细胞； 胁迫时间； 胁迫浓度； 电感耦合等离子体质谱法； 扫描透射电镜

近年来，研究重金属在植物细胞中的微区分布渐渐成为探索植物耐性机理的热点，一方面有利于在细胞水平上揭示重金属毒害植物机理，在重金属胁迫条件下，植物细胞结构会发生不同程度的损伤，主要在细胞膜、细胞核、内质网、高尔基体、叶绿体、线粒体、液泡等细胞器异常变化中体现出来[1]；另一方面可通过植物细胞器的损害程度来作为一种监测手段，为以后可能将植物作为重金属污染指示者奠定理论基础。

大量研究表明，超积累植物(如印度芥菜、遏蓝菜、东南景天、美洲商陆等)对镉的区隔化作用能有效降低细胞质内金属离子的浓度，是对重金属重要的耐受机制之一[2-4]。已有的研究表明，细胞壁作为重金属进入植物体的第一道屏障，在植物重金属耐受机理中的作用倍受关注[5-8]。由于细胞壁含有大量配体残基，对金属阳离子有高亲和力，通过包括离子交换、吸附、配位络合等作用结合重金属，进而影响重金属离子向细胞内扩散速率及吸收，以达到解毒的作用[9]。而液泡里富含各种蛋白质、糖、有机酸和有机碱等，都能与重金属结合耐受，常被认为是重金属离子贮存的主要场所[10-11]。通常采用扫描透射电镜(SEM)观察植物细胞超微结构的变化，反映重金属对植物细胞的危害程度。不同的研究者对戊二醛、锇酸采用不同的浓度，并用不同的试剂进行逐级脱水和染色，透射电镜扫描结果显示，在Cd胁迫下，植物细胞形成空的液泡，膜系统遭损坏，细胞线粒体和叶绿体也出现不同程度变化，高浓度下，导致细胞死亡[12-18]。由此可见，重金属对植物的毒害与其在植物体内各组织中的分布有关。同时，不同植物对镉的耐受程度也不同，胁迫时间和胁迫浓度是研究重金属毒害效应的两个重要参数。

本研究选取印度芥菜(BrassicaJuncea)为研究对象，进行室内植物培养，采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对印度芥菜根系和叶片细胞不同部位中的镉含量进行了测定，初步探讨了胁迫时间和胁迫浓度对镉在细胞中分布的影响。并借助扫描透射电镜技术观察了不同镉胁迫浓度下，根系和叶片细胞超微结构的变化，为进一步研究重金属对植物的毒害机理提供依据。

1 实验方法

1.1 仪器及主要试剂

Agilent 7500a电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent 公司)。工作参数：射频功率1350 W；采样深度5.7 mm；雾化器类型Babinton型；载气流速1.10 L/min。

透射电镜型号为TEM-1200EX(日本JEOL公司)。

镉标准储备液：1.0 mL/mg Cd。准确称取高纯0.1142 g氧化镉于烧杯中，加入50%的硝酸20 mL，加热溶解。冷却后移入100 mL 容量瓶中。以水定容，摇匀。使用时按需要逐级稀释。

实验中所用的硝酸、高氯酸、磷酸、锇酸、柠檬酸、醋酸均为优级纯试剂。

水：去离子水再经Milli-Q装置纯化(>18 MΩ·cm)。所有标准溶液和样品制备全部用Milli-Q纯化水。

1.2 植物培养

参照文献[19-20]的方法，选取积累型印度芥菜种子在培养箱中进行植物预培养。植株长成后分别用0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L镉胁迫1、5、7、10、14天。处理溶液的pH=5.8。

1.3 细胞分离

采用Wang等[21]建立的方法处理样品。称取适量植物根系或叶片，与10 mL预冷的提取液(内含 pH=7.5的50 mmol/L Tris-HCl、250 μmol/L蔗糖及1.0 mmol/L二硫代苏糖醇混合后加入少量液氮研磨成匀浆。匀浆于超高速冷冻离心机(Sigma 3K30)在3000 r/min下离心15 min，所得沉淀物即为细胞壁组分，其主要成分为细胞壁及其残渣。上清液在15000 r/min下离心30 min，最后所得上清液为细胞液(主要为液泡部分)及沉淀物(细胞器部分，主要为线粒体、叶绿体等)。整个过程全部在4℃条件下操作。分离后的各部分提取物用3～5 mL硝酸-高氯酸(体积比4∶1)消解后，用2%的硝酸定容至10mL，然后用ICP-MS测定Cd含量。

1.4 透射电镜切片处理

取1～3mm根尖，叶片取从顶部往下第5片叶子去叶柄并切成约1mm×1mm大小，包埋在2.5%的戊二醛溶液中，4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：倒掉固定液，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=7.0)漂洗样品三次，每次15min；用1%的锇酸溶液固定样品1～2h；倒掉固定液，再用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=7.0)漂洗样品三次，每次15min；之后用5种梯度浓度(50%、70%、80%、90%和95%)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；最后过渡到纯丙酮处理20min；用包埋剂(2.5%戊二醛)与丙酮的混合液(体积比1∶1)浸泡1h；用包埋剂与丙酮的混合液(体积比3∶1)浸泡3h；纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70～90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀-50%乙醇饱和溶液各染色15min，电镜观察。

2 结果与讨论

2.1 胁迫时间和胁迫浓度对亚细胞中镉分布的影响

为了研究镉在根系和叶片亚细胞各组织中的分布，考察胁迫时间和胁迫浓度对亚细胞各组织的区隔化作用大小的影响，印度芥菜分别用0.5、1.0、3.0、5.0、10.0mg/LCd标准溶液胁迫1、5、7、10、14天后收割，进行亚细胞组织分离后，观察亚细胞各组织中Cd的分布比例。随着胁迫时间的变化，各组织中Cd的含量差别不大，但随着胁迫浓度的变化，根系和叶片中Cd的含量都有变化。以刺激时间1天为例，结果见图1，随着胁迫浓度的增加，镉含量在根系细胞壁中占50%～62%，细胞液占22%～32%，细胞器占10%～17%。而在叶片中，镉含量在细胞壁中53%～64%，细胞液占27%～38%，细胞器占6.9%～9.0%，可以看出，镉含量在根系和叶片的细胞壁中所占比例显著高于细胞液和细胞器，随着胁迫浓度的增加，在细胞器中的比例反而降低，减少了对细胞的毒害。

本研究结果表明细胞壁作为重金属进入植物体的第一道屏障，在植物重金属耐受机制中起重要作用。而细胞壁对金属的固定作用不是一个普遍的抗金属毒害的机制。例如抗Zn毒和Zn敏感型菜豆的细胞壁物质表现出相似的亲和力[22]，而在对黄瓜、菠菜为材料研究发现，Cd在细胞壁上结合的量较少，而主要与细胞内成分结合[23]。因而细胞壁在超积累植物起多大作用，有待于进一步研究。

2.2 胁迫时间和胁迫浓度对亚细胞中镉含量的影响

胁迫时间(1、5、7、10、14天)和胁迫浓度(0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0mg/L)对亚细胞中Cd含量的影响如图2所示。总体上看，根系和叶片的亚细胞中镉含量与胁迫浓度和时间成正相关，随着胁迫时间和浓度的增大，根系和叶片亚细胞组织中镉含量增大，根系的亚细胞中镉含量远大于叶片亚细胞。说明Cd在植物体内的传输过程是由根至茎，再至叶。

图 1 胁迫浓度对细胞不同组织中镉分布的影响

Fig.1Effectofexposureconcentrationoncadmiumdistributionindifferenttissuesofcells

图 2 不同镉刺激浓度和时间下根系和叶片细胞中镉含量分布规律

Fig.2Subcellulardistributionofcadmiuminrootandleafsamples

图 3 不同镉浓度下印度芥菜根系的显微结构Fig.3 SEM maps of subcelluar under different cadmium disposal in root samplesChl—叶绿体；CP—细胞质；V—液泡；CW—细胞壁；M—线粒体；PM—细胞质膜；SG—淀粉粒；OG—嗜锇颗粒；N—细胞核。

胁迫时间和胁迫浓度对亚细胞中Cd含量的影响如下：胁迫时间低于7天时，亚细胞中镉含量缓慢上升;超过7天，亚细胞中镉含量显著升高，说明镉对植物的危害是一个缓慢过程。而且胁迫浓度低于1.0mg/L时，根和叶片的亚细胞中镉含量相差不大，结合植物生物量在1.0mg/L时最大的结果，推断植物对Cd的最大耐受量为1.0mg/L，超过此浓度植物的正常生长将受到影响[16]。

2.3 胁迫浓度对细胞超微结构的影响

图 4 不同镉浓度下印度芥菜叶片的显微结构Fig.4 SEM maps of subcelluar under different cadmium disposal in leaf samples

为了研究镉胁迫浓度对细胞超微结构的影响，对根和叶片用透射电镜分析，结果见图3和图4。图3结果表明，对照组(胁迫浓度0mg/L)印度芥菜根细胞的细胞器没有明显的损伤，植物细胞质膜及细胞壁表面光滑、清晰、连续，细胞质和细胞器丰富并基本充满整个细胞。不同浓度镉处理后，相比于对照组均出现了不同程度的结构破坏症状，随着胁迫浓度的增加，细胞破坏症状加重。1mg/L镉溶液处理后，根细胞的细胞质明显减少，细胞出现空泡化。5mg/L镉溶液处理后，症状进一步加重，并且发生了严重的质壁分离，质膜变得粗糙，出现许多沉积物。

图4结果表明，在未经Cd处理的对照组(胁迫浓度0mg/L)叶片样品中，细胞完整，叶绿体片层结构清晰，叶绿体呈椭圆形并有着规则的类囊体膜(对照)。Cd处理以后，印度芥菜叶片细胞出现了一些结构变化。1mg/L镉处理时，细胞结构有轻微的变化，到5mg/L镉处理时，开始出现质壁分离，液泡增大，叶绿体略微肿胀，基粒减少，片层结构松散，并且出现了一些嗜锇颗粒。随着镉胁迫浓度的增加，叶片细胞破坏症状表现与根系细胞类似。

3 结语

本文研究不同镉胁迫时间和胁迫浓度条件下镉在亚细胞中的分布比例和规律，结果表明随着胁迫时间的变化，各组织中Cd的含量变化不大；随着胁迫浓度增加，镉在根系和叶片细胞壁中所占比例显著高于细胞液及细胞器，而随着胁迫浓度的增加，镉在细胞器中的比例有所降低，减少了对细胞的毒害。说明细胞壁作为重金属进入植物体的第一道屏障，在植物重金属耐受机制中起重要作用。

胁迫时间和胁迫浓度对植物亚细胞中镉含量的影响说明镉对植物的危害是一个缓慢过程。超微结构研究也表明，镉胁迫浓度超过1mg/L后，细胞结构发生了不同程度的损坏；随着胁迫浓度的增加，细胞破坏症状加重。由此，在考察重金属对植物的危害时，要充分考虑时间和浓度梯度两个参数。重金属的亚细胞水平相关研究的深入，可望为揭示超积累植物中重金属的区隔化作用进一步提供理论参考。然而由于实验条件的限制，对于这些重金属如何进入相应组织(细胞)以获得区隔或解毒作用仍缺乏了解。

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Effect of Exposure Levels and Exposure Time on Subcellular Distribution of Cadmium in Indian Mustard (Brassicajuncea)

YANGHong-xia1,ZHANGHui-juan2,GAOJin-xu1,LIUWei1,LIBing1

(1.National Research Center for Geoanalysis, Beijing 100037, China; 2.College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agriculture University, Nanjing 230026, China)

Segmentation effect of super accumulation of heavy metals in plants which can reduce the concentration of metal ions in the cytoplasm of a cell is one of the important mechanisms of heavy metal detoxification. However, the compartmentalization effect from different tissues of a cell does not get a consistent conclusion. In order to evaluate whether intracellular compartmentalization could explain Cd detoxification mechanisms, the work described in this paper was designed to study the effect of exposure time and levels on Cd distribution of Indian mustard (Brassicajuncea) at the cell and sub-cell level. Root and leaf samples were exposed to 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 and 5.0 mg/L and harvested after 1, 5, 7, 10 and 14 days exposure. Cells were separated into three fractions: cytoderm, soluble fraction and organelle containing fraction using differential centrifugation technique, then Cr from all three fractions was determined by Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry (ICP-MS). Results showed that Cr in cytoderm, cytoplasm and organelles accounted for 50%-64%, 22%-38% and 7%-17% of total cadmium, respectively. It can be clearly indicated that the proportion of Cr in cytoderm is significantly higher than that in cytoplasm and organelles, indicating that compartmentalization of cytoderm plays a prominent role in Cd detoxification. As the exposure concentration and time increases, the content of Cd in cell fraction increases significantly especially after 7 days, which demonstrates that the effect of Cd on plant development is a slow process. Moreover, the excess of Cr stress concentration (>1.0 mg/L) would lead to deteriorative damage on plant cells, which was visually identified by TEM research, demonstrating different degrees of damages-plasmolysis, vacuolization and plasmalemma roughness, thus affecting the normal function of cells. These results suggest exposure time and levels are important parameters that must be taken into consideration in the study of the toxicity of heavy metals in plants.

cadmium; subcellular distribution; exposture time; exposure levels; Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry; Scanning Transmission Electron Microscopy

2013-10-08；

2014-02-21； 接受日期： 2014-06-04

国土资源部公益性行业科研专项(200911043-26)；中国地质大调查项目(12120113015400)

杨红霞，副研究员，博士，地球化学专业。E-mail： yanghongxia1@sina.com。

0254-5357(2014)05-0723-07

O614.242; O657.63; P575.2

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