吴清平，马延霞，2，3，张菊梅，韦献虎，2，3

（1广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070；2中国科学院广州化学研究所，广东 广州 510650；3中国科学院大学，北京 100049）

香豆素类荧光底物的合成及其在微生物检测中的应用进展

吴清平1，马延霞1，2，3，张菊梅1，韦献虎1，2，3

（1广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070；2中国科学院广州化学研究所，广东 广州 510650；3中国科学院大学，北京 100049）

香豆素类荧光底物主要是由作为荧光团的羟基香豆素和7-氨基-4-甲基香豆素或者它们的取代物的各类衍生物，包括糖苷类、羧酸酯类、磷酸酯类、肽类等。本文介绍了这些底物的合成方法。荧光团一般通过Pechmann缩合法合成，然后再与乙酰溴代糖、酰氯、亚磷酸酯、叔丁氧基保护的氨基酸等缩合生成相应的荧光底物，像4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷、4-甲基伞形酮辛酸酯和L-丙氨酰-7-氨基-4-甲基伞形酮等。将荧光底物加入到培养基中，可以实现对微生物的快速检测。荧光底物应用于微生物检测的依据是特异性酶反应，不同的荧光底物对应的酶和所检测的微生物不同。当单一底物不能有效检测和鉴定目标微生物时，采用复合底物能明显提高检测效果。此外，本文还指出了现有荧光底物存在的缺点，并对未来发展进行了展望。

荧光底物；4-甲基伞形酮；7-氨基-4-甲基香豆素；微生物检测

近年来，食品安全问题受到人们的日益关注，已经在全世界范围内引起高度重视。而食源性致病菌是引起食源性疾病的重要原因，是食品安全的重大隐患[1]。近年来由食源性致病菌引发的疾病呈上升趋势。如大肠杆菌O157：H7引起了近万人中毒[2]。因此对致病菌进行快速有效的检测就显得尤为重要。传统的检测方法（如分离培养、生化鉴定等）对致病菌的检测特异性不高、灵敏度低、操作繁琐耗时，不能实现快速检测。近年来，特异性酶底物合成和应用发展迅速，已经广泛应用于微生物检测。该方法是将荧光底物或显色底物加入到培养基中，微生物代谢过程中产生的特异性酶将底物分解，释放出色原（直接显色）或荧光团（需在紫外灯下照射显色），从而实现对微生物的检测和鉴定[3]。尽管特异性显色酶底物法具有操作简便、灵敏性高、特异性好、检测时间短等优点，但是要将该方法作为日常检测方法成本较高，主要是因为现有荧光底物和显色底物的合成工艺复杂、产率低、价格昂贵。因此迫切需要开发出简单易行的合成工艺，降低酶底物的生产成本。近年来通过对常见食源性致病菌显色培养基及其显色底物进行深入研究，目前已成功制备出显色底物磷脂酰基醇（PI）用于检测单核细胞增生性李斯特菌[4]，与进口产品效果相当，明显降低了检测成本。

目前国内外应用的荧光底物主要是4-甲基伞形酮和7-氨基-4-甲基香豆素的各类衍生物，包括糖苷类、酯（脂）类、肽类等。4-甲基伞形酮主要用于检测酯（脂）水解酶、糖苷酶等，7-氨基-4-甲基香豆素用与检测肽酶或蛋白酶。本文归纳和总结了荧光底物的研究进展，以为它们的合成提供参考。

1 4-甲基伞形酮和7-氨基-4-基香豆素的合成

1.1 4-甲基伞形酮的合成

合成4-甲基伞形酮的方法主要有Perkin法、Konevenagal法、Reformatsky法、Wittig法及Pechmann法等方法[5]。其中因Pechmann法合成4-甲基伞形酮所用的原料间苯二酚和乙酰乙酸乙酯便宜易得，且产率高，因此最常被用来合成4-甲基伞形酮。Pechmann反应制备4-甲基伞形酮影响产率的一个重要因素是反应中使用的催化剂。传统的催化剂像浓硫酸等液体酸催化剂存在许多不足，如反应时间长，催化剂大大过量且不能回收循环使用，反应产生的废酸污染环境，催化剂腐蚀设备等。为此，国内外研究者不断研究和探索了多种新型催化剂。一些路易斯酸性的盐类像TiCl4[6]等，催化剂用量少，反应时间短，产率高，但是不能回收重复利用，且所含金属元素一般是稀有金属元素，价格昂贵。无机盐NaHSO4·H2O[7]催化合成4-甲基伞形酮用量少，且便宜易得，但是不能回收利用。利用[Bmim]PF6、[Bmim]BF4[8]等离子液体为溶剂兼催化剂合成4-甲基伞形酮产率高达95%，且离子液体可以回收重复利用而产率没有明显的下降。杂多酸像磷钨酸[9]、H4SiW12O42·15H2O[10]等催化Pechmann缩合反应，反应无溶剂，后处理简单，符合绿色化学的要求。4-甲基伞形酮合成路线见图1。

图1 4-甲基伞形酮的合成

1.2 7-氨基-4-甲基香豆素的合成

7-氨基-4-甲基香豆素（简称香豆素-120）是重要的荧光物质。因为7位的氨基存在，易与肽链末端羧基缩合形成多肽-香豆素类荧光底物，已成功地应用于微生物检测、免疫检测、生化酶学和多肽合成等研究领域。有关7-氨基-4-甲基香豆素合成的报道不是很多。传统的合成7-氨基-4-甲基香豆素的方法就是以间氨基苯酚和乙酰乙酸乙酯为原料在浓硫酸催化下经Pechmann缩合反应制得[11]。利用微波辅助技术graphite∶K10（2∶1）[12]为催化剂直接由间氨基苯酚和乙酰乙酸乙酯出发合成7-氨基-4-甲基香豆素。相对于传统的合成方法，此方法避免了使用浓硫酸，经济环保，可行性高。7-氨基-4-甲基香豆素的合成路线见图2。

图2 7-氨基-4-甲基香豆素的合成

2 香豆素类荧光底物的合成

酶底物可以是糖苷、肽类、酯（脂）类、核苷酸等。目前已经开发出来的香豆素类荧光底物包括糖苷类、羧酸酯类、磷酸酯类、硫酸酯类、肽类等。这些底物中，糖苷类荧光底物的研究和应用最多、最广泛。

2.1 糖苷类荧光底物的合成

糖苷类化合物的合成方法很多，如Koenigs-Knorr法、相转移催化法、酰卤法、三氯乙酰亚氨酯（Schmidt）法、卤代乙酸酯法、硫苷法以及酶促法等。文献报道的香豆素类糖苷化的糖基供体一般是全乙酰的溴代糖，所用方法主要是Koenigs-Knorr 法[13]。Koenigs-Knorr法是最早发现的糖苷化反应之一，在银盐或汞盐的催化下，全乙酰溴代糖作为糖基供体和受体发生糖苷化反应。该反应产率不高，且全乙酰溴代糖不稳定，采用的重金属促进剂会产生大量对环境不友好的废液。三氯乙酰亚胺酯作为糖基供体时，反应是由BF3·Et2O催化的[14]。BF3·EtO2催化糖苷化反应时，避免了使用不稳定的溴代糖，反应产率相对较高，但是该反应需要在严格无水的条件下进行。4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖苷酸还可以由4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖苷氧化得到[15]。相对于Koenigs-Knorr法，这种方法总产率明显要高。几种糖苷类荧光底物常用的合成方法见图3、图4和图5。

图3 7,8-二羟基-4-甲基香豆素-β-D-葡萄糖苷的合成

图4 4-甲基伞形酮基-α-D-甘露糖苷的合成

2.2 羧酸酯（脂）类荧光底物的合成

羧酸酯类荧光底物是由香豆素类和酸酐、酰氯在吡啶中反应制得[16]。乙酸酯和丁酸酯的产率和纯度都很高。香豆素类羧酸酯（脂）的合成路线见图6。

图6 香豆素类羧酸酯（脂）的合成

2.3 磷酸酯酶类荧光底物的合成

磷酸酯酶类荧光底物主要是由三氯氧磷法合成。香豆素类和三氯氧磷在0℃，吡啶的溶液中反应[16]，直接得到磷酸单酯，方法简单。但是后处理提取产物时必须严格控制pH值为6，产物以吡啶盐的形式被提取出来，粗产率比较高，后处理过程中会损失掉相当一部分产物。最终产率不足45%。 Kumar等[17]用亚磷酸酯法合成了香豆素的磷酸酯。这种方法具有反应温和、反应副产物少等诸多优点。图7为磷酸酯酶类荧光底物的合成路线。R为苯基、羧基、苯并唑基等。图8为4-甲基伞形酮磷酸酯的合成路线图。

图7 磷酸酯酶类荧光底物的合成

图8 4-甲基伞形酮磷酸酯的合成

2.4 硫酸酯酶类荧光底物的合成

硫酸酯酶类荧光底物由香豆素类和氯磺酸在吡啶中反应生成[16]。通过吡啶盐分离产物，产率和纯度都比通过碱金属盐分离要好很多。图9为硫酸酯酶类荧光底物的合成方法，其中R=2-苯并噁唑基、苯并噻唑基或苯基。

图9 硫酸酯酶类荧光底物的合成

2.5 肽类荧光底物的合成

肽类荧光底物由7-氨基-4-甲基香豆素和苄氧羰基保护的氨基酸缩合而成[18]。苄氧羰基保护的氨基酸和7-氨基-4-甲基香豆素溶于二氯甲烷中，0～5℃搅拌下加入二环己基碳二亚胺（DCC）和4-N,N二甲基吡啶，室温下搅拌反应24h得到苄氧羰基保护的底物。脱保护基苄氧羰基常用的方法是三氟乙酸法和盐酸法。图10为肽类荧光底物的合成路线。

图10 氨肽酶类荧光底物的合成

3 香豆素类荧光底物在微生物检测中的应用

荧光底物应用于微生物检测的原理是微生物代谢过程中产生的特异性酶可以分解荧光底物，释放出荧光团，紫外灯下照射（4-甲基伞形酮的激发波长365nm，发射波长440nm；7-氨基-4-甲基香豆素的激发波长370nm，发射波长440nm）会发出荧光，显示一定的颜色。如果培养基中含有目标微生物，就会将荧光底物分解，从而在紫外灯下照射时，培养基会显示特定颜色的荧光（4-甲基伞形酮发蓝色荧光），从而可以确定目标菌的存在。国外关于荧光底物应用于微生物检测的研究和报道已经很多。如Berg等[19]用4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷、4-甲基伞形酮-庚酸酯和4-甲基伞形酮-葡糖酸苷检测了饮用水中的总大肠菌群数。将4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷加入到琼脂培养基中再结合膜过滤技术，在6h内对大肠菌群的检出限度可达1CFU/100mL。香豆素类荧光底物所对应的的酶及其所检测的目标微生物见表1。

有时一种单一的荧光底物并不能准确的检测和鉴定某种微生物，这时结合另外一种技术或将荧光底物和显色底物结合起来使用就会达到理想的效果。4-甲基伞形酮基-辛酸酯检测沙门氏菌时灵敏度高、速度快、易操作，但是特异性不是很高，常会出现假阳性结果。而假阳性结果中的绝大多数有氧化酶活性的，所以Freydiere等[32]、Mannafi等[33]将4-甲基伞形酮基-辛酸酯和氧化酶测试结合起来检测沙门氏菌，所得到的结果更加准确、可信。Mannafi等[34]将荧光底物L-焦谷氨酰-7-羟基-4-甲基伞形酮和显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃葡萄糖苷结合起来使用可以区分肠球菌和化脓性链球菌。肠球菌能够分解这两种底物，而化脓性链球菌只能分解L-焦谷氨酰-7-羟基-4-甲基伞形酮，因而可以它们区分开来。

4 结 语

表1 常见的一些香豆素类荧光底物及其检测的目标微生物

荧光底物因其灵敏度高、检测速度快等优点已广泛应用于微生物检测工作中。但是香豆素类荧光底物也有其自身的缺点：对pH值有依赖性、固体培养基中易扩散、有些不稳定且不溶于水，这些缺点限制了其在微生物检测中的应用[35]。因此，新荧光底物的开发显得尤为重要。Markaryan和Voznyi[36]合成了3-氰基-4-三氟甲基香豆素基-β-D-吡喃半乳糖苷，并应用于β-D-半乳糖苷酶的测试，发现3-氰基-4-三氟甲基香豆素的pKa比4-甲基伞形酮要低，更适合于低pH值环境中的检测。Chilvers 等[37]合成了7-羟基-3-甲酸乙酯香豆素-β-D-吡喃半乳糖苷。pH=6时，7-羟基-3-甲酸乙酯香豆素的荧光强度比4-甲基伞形酮的高5倍以上，而且毒性更低，检测速度也更快。

关于荧光底物的合成和在微生物方面的应用，国外已经发展的比较成熟，且已经有商品化的培养基，但是我国关于这方面的文献报道却很少。近年来国内所需荧光底物大多需要依赖进口，价格十分昂贵，严重制约着我国在利用显色培养基技术检测微生物方面的发展。因此，急需开发出我国简单易行的合成工艺，降低荧光底物的生产成本，促进荧光底物应用于微生物检测技术的发展。与此同时，还应该开发出更加优化的荧光底物，丰富荧光底物的种类。目前已成功研制出4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷的实验室合成工艺，为进一步合成其他荧光底物打下了良好基础。

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Progress in syntheses of coumarin fluorogenic substrates and their application in microbial detections

WU Qingping1，MA Yanxia1，2，3，ZHANG Jumei1，WEI Xianhu1，2，3
（1Guangdong Institute of Microbiology，South China State Key Laboratory of Applied Microbiology，（Ministry-Province Jointly Developed），Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，Guangzhou 510070，Guangdong，China ；2Guangzhou Institute of Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650，Guangdong，China；3University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Coumarin fluorogenic substrates are mainly derivatives of fluorophore，such as hydroxycoumarin and 7-amino-4-methyl coumarin or their substitution，including glycosides，carboxylic esters，phosphate，peptides and the like. This review introduces the synthesis of these substrates. Fluorophores are generally synthesized by Pechmann condensation，then their condensation with acetyl bromide sugar，acyl chloride，phosphite ester andtert-butoxy-protected amino acids generate the corresponding fluorogenic substrate，like 4-methylum belli feryl-β-D-galactopyranoside，4-methylumbelliferyl caprylate，L-alanyl-7-amino-4-methylumbelliferone and the like. The fluorescent substrates are added to the media to achieve rapid detection of microorganisms.The application of fluorogenic substrates in microbiological testing is based on specific enzyme reactions. Different fluorescent enzyme substrates correspond to different enzymes which target different microorganisms.When a single substrate can not effectively detect and identify the target microorganisms，the composite substrates can be used to improve the detection results. In addition，problems of the existing fluorogenic substrate in microbial detection are pointed out，and future directions are discussed.

fluorogenic substrates；methylumbelliferone；7-amino-4-methylcoumarin；microbiological detection

TQ 206

A

1000-6613（2014）09-2444-07

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.09.035

2014-01-03；修改稿日期：2014-01-20。

广东省科技计划（2011A011303001）及广东省自然科学基金研究团队项目（S2012030006235）。

及联系人：吴清平（1962—），男，研究员，博士，研究方向食品微生物安全监测与控制技术研究。E-mail wuqp203@163.com。