李小清，汤 成，潘永林，黄文祥

（1.重庆市中医院 肝病科，重庆 400021；2.重庆市九龙坡区疾病预防控制中心 慢病科，重庆 400039；3.重庆医科大学附属大学城医院 消化中心，重庆 401331；4.重庆医科大学第一附属医院 感染科，重庆 400016）

β-内酰胺类抗菌药物在临床广泛应用， 导致产生β-内酰胺酶的耐药菌株不断增多。 阿莫西林（amoxicillin，AMO）是一种半合成的广谱青霉素，属氨基青霉素类；对流感嗜血杆菌、大埃希菌奇异变形杆菌、沙门菌属、痢疾志贺菌、脑膜炎奈瑟菌和不产酶淋病奈瑟菌等革兰阴性菌有很强的抗菌活性，对钩端螺旋体、梅毒螺旋体也有较好的作用，但AMO 不能抑制可产生β-内酰胺酶的金黄色葡萄球菌和肠杆菌[1]。 将β-内酰胺类抗菌药物与β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦（tazobactam，TAZ）联合应用，拮抗β-内酰胺酶的水解作用，提高抗菌活性，已受到广泛重视[2，3]。本研究观察了不同配比AMO/TAZ 的体内外抗菌作用， 为临床应用提供实验依据。

1 试验材料与方法

1.1 药物

注射用AMO：规格1.0g/瓶； 批 号L020601； 含 量96.7%； 注射用TAZ： 规格0.1g/瓶； 批号0201001； 含量90.7%。 山东齐鲁制药厂生产。 准确称取各种试验所需药品，加入生理盐水配制成浓度为2560mg/L 的原液。不同配比的药物AMO/TAZ（1∶1、2∶1、4∶1、8∶1）由原液配制。

1.2 实验动物

昆明种小鼠体重20g±2g，250 只，雌雄各半。 动物来源重庆医科大学实验动物中心； 级别： 清洁级； 许可证号：SCXK（渝）2012-0001。

1.3 受试细菌

实验所用临床分离菌株包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、肠杆菌属、鲍曼不动杆菌、沙门氏菌、沙雷氏菌属、枸橼酸杆菌、其他克雷伯菌、铜绿假单胞菌、其他假单胞菌、志贺氏菌等14 种421 株， 其中产酶菌231 株， 产酶率为54.87%。 每株细菌在实验前均经琼脂平板分纯，37℃过夜培养，稀释到0.5 麦氏点用于实验。 每次实验均用大肠埃希菌ATCC25922、 金黄色葡萄球菌ATCC25923 和铜绿假单胞菌ATCC27853 作为药敏实验质控菌株。 细菌在MH培养基、MH 肉汤培养基中37℃培养18～20h。

1.4 琼脂二倍稀释法检测MIC[4]

1.4.1 含药琼脂制备

将已稀释的抗菌药物加入灭菌的MH 琼脂（45～50℃）中充分混匀， 倾入平皿琼脂厚度为4mm。 药物浓度梯度：0.0625，0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0，64.0，1 28.0，256.0 mg/L。

1.4.2 细菌接种

将0.5 麦氏比浊度菌液稀释10 倍， 以多头接种器吸取约1～2μl 接种于含药琼脂表面，每点菌数约104CFU，稀释的菌液于15min 内接种完毕。

1.4.3 结果判定

在质控菌株实验结果正确的基础上，将平板置于暗色无反光表面判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释浓度为终点浓度。

1.5 感染保护实验[5～7]

1.5.1 菌液稀释方法

将致病性大肠埃希菌于实验前1d 接种于2ml 营养肉汤中，37℃培养6h， 取此菌液0.1ml 转种于10ml 营养肉汤内，37℃培养18h，即为实验用菌原液。 将菌原液适当稀释，用5%高活性干酵母液稀释至100%最低致死量（MLD）。

1.5.2 （ED50）动物保护实验

实验小鼠随机分为AMO 组，AMO/TAZ （1∶1，2∶1，4∶1）组和空白对照组（注射同体积的生理盐水）；每组6 个浓度（各药物用生理盐水溶解后，稀释至所需浓度，2 个相临剂距为0.25～0.5），每个浓度10 只，雌雄各半。 实验组每只小鼠腹腔注射菌量1MLD 菌液0.5ml 以感染小鼠，1h 后皮下给予各组药0.2ml。 记录感染后24h、48h 和72h 各给药组及空白对照组小鼠的死亡数或存活数。

1.6 数据处理

用BLISS 法计算ED50值和ED50的95%可信限， 应用方差分析对数据进行统计分析。

2 结果

2.1 体外抗菌作用

对421 株试验菌在4 种配比AMO/TAZ 联合用药和单用AMO 的MIC50、MIC90进行测试。 对不同配比AMO/TAZ和AMO 间的MIC50进行比较， 经方差分析发现AMO/TAZ（1∶1，2∶1，4∶1）3 种配比与单用AMO 的MIC50差异有统计学意义。 结合不同配比AMO/TAZ 的MIC50显著高于AMO菌种数，以AMO/TAZ 的2∶1、4∶1 配比最佳。 详见表1。

2.2 感染保护试验

体内保护试验结果，AMO 的ED50值为238.32mg/kg，ED95在447.72mg/kg； 而AMO/TAZ （2∶1、4∶1）ED50分别为46.61mg/kg、51.40mg/kg，比AMO（1∶0）低5 倍左右，差异有统计学意义；AMO/TAZ（2∶1）与AMO/TAZ（4∶1）间ED50差异无统计学意义（见表2）。

表2 AMO/TAZ （2∶1，4∶1）对大肠埃希菌感染小鼠的保护作用

表1 不同比例配比AMO/TAZ 与AMO 的MIC50 比较

3 讨论

AMO 在临床上常用于敏感菌所致的各种感染， 随着其广泛使用， 产生β-内酰胺酶的耐药株不断增多， 单用AMO 对产酶菌株感染无效。 将β-内酰胺酶抑制剂-TAZ与AMO 联合，不仅能克服相应耐药性，还能拓宽抗菌谱，增强抗菌活性。 我们以国产AMO/TAZ 及其单组分进行的体内和体外抗菌活性研究结果显示： 联合用药比单用AMO 的抗菌活性高，抗菌谱也扩大，但几个比配之间有一定差别，无论从MIC 及体内保护试验，AMO/TAZ（2∶1）的抗菌效果均要略强于AMO/TAZ （4∶1）， AMO/TAZ 2∶1 为最佳抗菌配比，与文献研究一致[8]。

综上所述，AMO 联合TAZ 后，抗菌活性明显增强。 对所有产酶的革兰氏阳性球菌有较强的抗菌作用；对产酶的革兰氏阴性菌（特别是产ESBLS的菌株）除嗜麦芽胞杆菌及铜绿假单胞菌外也有较强的抗菌作用。 总之，酶抑制剂TAZ 的加入，扩大了AMO 的抗菌谱，增强了抗菌作用，提示临床疗效可能更好，具有进一步开发研究的价值。

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