丁柏英刘丽华* 谢朝辉张 杰齐洁敏贺 宇张振满娄丽华马建华蔡君东许新征

（1 承德市肿瘤医院，河北 承德 067000；2 承德市中心医院，河北 承德 067000；3 承德医学院，河北 承德 067000；4 宽城县中医院，河北 宽城 067600；5 承德医学院附属医院，河北 承德067000）

整合素α5β1与CD44V3在胃癌中的表达及临床意义

丁柏英1刘丽华1* 谢朝辉1张 杰2齐洁敏3贺 宇2张振满4娄丽华5马建华2蔡君东1许新征2

（1 承德市肿瘤医院，河北 承德 067000；2 承德市中心医院，河北 承德 067000；3 承德医学院，河北 承德 067000；4 宽城县中医院，河北 宽城 067600；5 承德医学院附属医院，河北 承德067000）

目的本研究旨在探讨整合素α5β1、CD44V3表达水平对胃癌细胞黏附、迁移、髓外浸润过程的影响。方法采用Western blot检测法及RT-PCR分别测量HTB-103、CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973等不同对数生长期的胃癌细胞株整合素α5β1、CD44V3蛋白表达水平及整合素α5β1mRNA、CD44V3mRNA水平. 将不同胃癌细胞株随机分为实验组及对照组，实验组加入整合素α5β1、CD44V3抗体, 对照组加入同型IgG，观察两组胃癌细胞与ECV304细胞系的黏附率、细胞迁移率及胃癌细胞穿过人工基质膜的浸润能力。结果CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973细胞整合素α5β1mRNA相对表达量明显高于HTB-103细胞（P<0.05）。观察组CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973细胞株黏附率、迁移率、及浸润率显著低于对照组（P<0.05），而两组HTB-103细胞无统计学差异（P>0.05）。结论整合素α5β1、CD44可能参与胃癌细胞的形成、聚集、生长及浸润的过程，其表达水平与胃癌病程进展具有密切的关系。

整合素α5β1；CD44V3；胃癌细胞；髓外浸润

胃癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，同时也是目前世界上高发的恶性肿瘤之一，患者早期症状不典型难，发现时已属中晚期，失去最佳手术时机，因此胃癌患者预后差，5年生存率仅为5.8%～12.4%[1]。近年随着新型化疗药物及生物分子学的发展，使得胃癌临床诊治取得了一定的进展，但胃癌患者预后效果仍不理想，患者病死率高，究其原因是由于胃癌早期诊断困难，当确诊时大多数已发生移，从而影响预后[2]。因此，寻找有效鉴定早期胃癌诊断的标志物及其与胃癌侵袭、浸润及转移的关系对临床提高胃癌患者治愈效果，延长胃癌患者生存期限具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 主要生化试剂及试剂盒，见表1。

表1 主要生化试剂及试剂盒

1.2 实验步骤

1.2.1 胃癌细胞的分离及培养：分离方法参考Mylonas I以及Tsai SJ的方法进行培养及加以改良。

1.2.2 RT-PCR法检测胃癌细胞株α5β1、CD44V3mRNA表达。

1.2.3 Western blot检测胃癌细胞株CD44蛋白表达。

1.2.4 胃癌细胞体外黏附、迁移、浸润试验：①体外黏附实验：用酶联免疫检测仪测定吸光度，计算胃癌细胞黏附率。②胃癌细胞髓外迁移能力：计数下层细胞迁移数。③体外浸润实验：记录穿过基质膜细胞平均值，记录读数。

1.3 统计学处理：采用SPSS17.0统计学软件对数据进行分析，计量资料标准差表示，组间计量资料采用t检验，采用Pearson相关分析对整合素 mRNA表达水平及CD44V3关系进行分析，P<0.05被认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同胃癌细胞株整合素α5β1、CD44V3mRNA表达水平分析：CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973细胞整合素α5β1mRNA、CD44V3mRNA相对表达量为与HTB-103细胞整合素α5β1mRNA、CD44V3mRNA相对表达量相比，差异有统计学意义（P<0.05），见表2和图1。

表2 不同的胃癌细胞株整合素α5β1、CD44V3mRNA表达水平分析

表2 不同的胃癌细胞株整合素α5β1、CD44V3mRNA表达水平分析

注：与HTB-103组比，aP<0.05

?

表3 不同胃癌细胞株与对照组细胞株黏附率、迁移率及浸润情况分析

表3 不同胃癌细胞株与对照组细胞株黏附率、迁移率及浸润情况分析

注：与对照组相比，aP<0.05

图1 不同胃癌细胞株整合素α5β1、CD44V3mRNA表达水平分析

2.2 不同胃癌细胞株整合素α5β1、CD44V3蛋白表达水平分析：通过免疫组织化学测定可知，整合素α5β1、CD44V3蛋白在CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973细胞核中棕黄色颗粒，而整合素α5β1、CD44V3蛋白在HTB-103内几乎不达。见图2～图5。

图2 胃癌CRL-5822细胞株整合素α5β1免疫组化结果

图3 胃癌CRL-5971细胞株整合素α5β1免疫组化结果

图4 胃癌CRL-5822细胞株CD44V3表达情况

图5 胃癌CRL-5971细胞株CD44V3表达情况

2.3 观察组与对照组不同白细胞株黏附率、迁移率及浸润率分析：观察组CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973细胞株黏附率、迁移率及浸润率显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而两组HTB-103细胞黏附率、迁移率及浸润率无统计学差异（P>0.05），见表3。

3 讨 论

3.1 整合素α5β1与胃癌细胞黏附、转移及浸润的关系：整合素是一类重要的细胞表面受体，其作用是介导细胞外基质（ECM）与细胞黏附。肿瘤的发生是细胞信号系统缺陷性疾病，整合素作为信号的传导者目前已被证实其表达水平的下降与肿瘤的转移及细胞转化具有密切的关系[3]。近年不少研究证实[4]在癌细胞内不同的整合素其表达水平存在一定的差异，这提示整合素可通过诱导基因或传递特定信号基因表达来调控肿瘤细胞的转化、生长、侵袭及调亡等一系列生理变化过程。整合素在肿瘤中的表达主要表现为三种变化形式，整合素的改变及表达水平的减少或增加[5]。在正常组织或恶性肿瘤中整合素的表述水平存在一定的差异，在胃癌转移细胞中可发现整合素α5、α6持续高表达。牛晓敏等[6]研究指出，整合素可与ECM分子黏附连接并在细胞外基质上铺展，而细胞上的整合素在细胞黏附面上分布不均匀，且呈斑点样分布。肿瘤的异常分化是由于细胞异常增殖引起的，机体中细胞增殖不仅由细胞核有丝分裂控制，同时胞外的一些物质如纤维蛋白也可参与细胞有丝分裂过程，细胞是通过跨膜受体上的整合素成分黏附其上。

本研究中免疫组化法结果均显示，CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973细胞整合素α5β1蛋白表达量均高于HTB-103，在HTB-103细胞中表达量极低。经PCR进一步证实，整合素α5β1在HTB-103细胞中的表达非常微小甚至不表达。黏附实验显示，观察组整合素α5β1单抗经预处理后CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973细胞株黏附率显著低于对照组，且CRL-5822下降水平较为显著。CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973细胞迁移及髓外浸润能力显著高于HTB-103，从而推断出CD44可参与胃癌细胞基质外黏附、迁移、浸润过程，与胃癌病情进展关系密切。

3.2 CD44V3与胃癌细胞黏附、转移及浸润的关系：黏附分子CD44属于细胞表面跨膜糖蛋白受体，其可与透明质酸（HA）结合生成高分子黏多糖，介导淋巴细胞归巢、细胞外基质黏附等多种生理病理反应。近年纵多的研究表明[7]，黏附分子CD44高度表达与肿瘤生成、转移过程关系密切。Schlaepfer[8]以CD44为靶点分子，通过阻断CD44与HA结合从而抑制肿瘤生成及转移，起到靶向治疗的作用。Guibso[9]等通过运用CD44单克隆抗体、CD44V10受体蛋白及CD44s蛋白阻断肺癌小鼠细胞中CD44与HA的结合，结果显示，肺癌小鼠不经任何治疗的情况下，其CD44v10及受体蛋白在肺部的转移量分别下降了60%及70%。Hayashi[10]等发现急性胃癌患者血清CD44水平显著高于正常体检者，其患者放化疗后血清CD44水平居高不下者较血清CD44正常者更容易出现复发，从而推测胃癌病情进展可能与血清CD44水平增高有关。PeHegrim[11]等指出肺癌患者淋巴结外转移、临床分期较高的患者其血清CD44水平较高。Kim[12]等发现急性胃癌Ⅱ～Ⅲ期患者血清CD44水平显著高于0～Ⅰ期患者。从以上研究可推断出，CD44表达水平可作为某些肿瘤病情发展的预测指标，通过测定血清CD44可有效评价肿瘤恶性程度及预后效果。

本研究中免疫组化法结果均显示，CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973细胞CD44蛋白表达量均高于HTB-103，CD44在HTB-103细胞中表达量极低。经PCR进一步证实，CD44在HTB-103细胞中的表达非常微小甚至不表达。黏附实验显示，观察组CD44单抗经预处理后CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973细胞株黏附率显著低于对照组，且CRL-5822下降水平较为显著。CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973细胞迁移及髓外浸润能力显著高于HTB-103，从而推断出CD44可参与胃癌细胞基质外黏附、迁移、浸润过程，与胃癌病情进展关系密切。目前关于CD44在胃癌中髓外浸润的机制还有待进一步研究，但相关研究指出，CD44参与肿瘤的形成、生长、转移及髓外浸润与基质金属蛋白酶活性有关。

[1] 赵东晖,徐惠绵,孙秀菊等.腹腔液中CD44和整合素β1表达与胃癌腹膜转移的关系[J].世界华人消化杂志,2007,15(11):1288-1291.

[2] 金鲁明,张海涛,郭成浩,等.胃癌组织中CD44V6和整合素α5β1的表达及其意义[J].中华肿瘤防治杂志,2006,13(18):1409-1411.

[3] 盛亚琳.细胞黏附分子CD44与肿瘤关系的研究进展[J].实用医技杂志,2008,15(7):926-928.

[4] 张素贞,张凡,常永霞,等.淋巴归巢受体P选择素、CD44、α6β1在宫颈癌中表达与淋巴转移关系研究[J].中国老年学杂志,2010,30(1): 16-18.

[5] 郜玉峰,李旭,谢琴秀,等.骨桥蛋白和CD44v6在肝癌中的表达及意义[J].中华肝脏病杂志,2005,13(3):227-228.

[6] 牛晓敏,张杰,陆舜,等.细胞黏附分子在肿瘤骨转移中的作用[J].中国癌症杂志,2008,18(5):393-398.

[7] 董武,董齐,王振宁,等.靶向CD44和整合素β1基因防治胃癌、卵巢癌腹膜转移的研究[D]沈阳:辽宁省人民医院,中国医科大学,2004.

[8] Schlaepfer DD,Hunter T.Htegrin signalling and tyrosine phosph02 rylafion:just the FAl[J].rends Cell Biol,1998,8(4):1512-157.

[9] Uu G,Guibso CD,Zheng J.Structural insight into the mechanisms of targeting and signaling offocal adhesion kinase[J].Mol Cell Bi01.2002,22(8):2751-22760.

[10] Hayashi I,Vuofi K,Liddington RC.The focal adhesion targeting(FAT)resio,,of focal adhesionkinase is a four2helix bundle that binds paxillin[J].Nat Struet Biol,2002,9(2):101-106.

[11] PeHegrim S,DusanterFourt I.The structure regulation and function of the Janus kinases(JAKs)and the signal transducers and activators of transcription(STATs)[J].Eur J Biochem,1997,248(3):615-633.

[12] Kim S,Harris M,Vamer JA.Regulation of integrin alpha(V)beta3一mediated endothelial cellmigration and angiogenesis by integfinalphaSbetal and protein kinase A[J].J Biol Chem,2000,2 75(43):33920-33928.

The Expression and Clinical Significance of Integrin α5β1 and CD44V3 in Gastric Cancer

DING Bo-ying1, LIU Li-hua1*, XIE Zhao-hui1, ZHANG Jie2, QI Jie-min3, HE Yu2, ZHANG Zhen-man4, LOU Li-hua5, MA Jian-hua2, CAI Jun-dong1, XU Xin-zheng2
(1 Chengde Tumor Hospital, Chengde 067000, China; 2 Chengde Central Hospital, Chengde 067000, China; 3 Chengde Medical College, Chengde 067000, China; 4 Kuangcheng TCM Hospital, Kuancheng 067600, China; 5 Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, China)

ObjectivesThis study aimed to investigate the integrin α5β1, CD44V3expression levels of gastric cancer cell adhesion, migration , the impact of extramedullary infiltration process and its relationship with clinical features of gastric cancer.MethodsUsing Western blot and RT-PCR assays were used to measure HTB-103, CRL-5822, CRL-5971 and CRL-5973 , such as different logarithmic phase of gastric cancer cell lines integrin α5β1, CD44V3protein levels and integrin α5β1mRNA, CD44V3mRNA level. different gastric cancer cell lines were randomly divided into experimental group and control group, the experimental group was added integrin α5β1, CD44V3antibody isotype control group added IgG, were observed in gastric cancer cells and ECV304 adhesion rate cell lines , cell mobility and the ability to artificial gastric cancer cell invasion through the matrix of the film.ResultsCRL-5822, CRL-5971 and CRL-5973 cells relative expression of integrin α5β1mRNA were significantly higher than the HTB-103 cells (P <0.05). observation group CRL-5822, CRL-5971 and CRL-5973 cell line adhesion rate mobility, and infiltration rate significantly lower than the control group adhesion rate(P<0.05), while the two HTB-103 cell adhesion rate , migration rate and infiltration rate was no significant difference (P> 0.05).ConclusionsIntegrin α5β1, CD44may be involved in the formation of gastric cancer cell aggregation, the process of growth and invasion , and its expression level and progression of gastric cancer have a close relationship.

Integrin α5β1; CD44V3; Gastric cancer cells; Extramedullary infiltration

R735.1

B

1671-8194（2014）34-0187-03

*通讯作者：E-mail： 450309836@qq.com