王 芬 张雪玲 李建绪*

（青岛市市立医院药学部，山东 青岛 266011）

大孔树脂分离黄杞叶总黄酮的研究

王 芬 张雪玲 李建绪*

（青岛市市立医院药学部，山东 青岛 266011）

目的通过研究确定黄杞叶总黄酮大孔树脂吸附工艺参数。方法通过大孔吸附树脂对黄杞叶黄酮成分的吸附-洗脱性考察，来确定各工艺参数。结果D101树脂对黄杞叶总黄酮具有较好分离作用，黄杞叶总黄酮动态饱和吸附量为55 mg/g；当药材树脂比为1∶2，树脂柱径高比为1∶7，上样药液为水提液，浓度相当于生药浓度0.4 g/mL，以水、10%乙醇、60%乙醇进行洗脱，洗脱量分别为10、10和5倍树脂柱量，收集60%醇洗部分，减压浓缩至干，即得黄杞叶总黄酮提取物。结论采用D101树脂对黄杞叶总黄酮具有较好分离作用，总黄酮回收率在90%以上。

黄酮；黄杞叶；树脂

黄杞叶为胡桃科植物黄杞（engelhardtiarox bur ghiana wall）的干燥叶。该植物分布于广东、广西、云南等，资源丰富。黄杞总黄酮具有抗凝、降脂、降糖和增强机体免疫力的作用[1-3]。大孔树脂具有选择性吸附有机化合物的能力，可应用于中药有效成分的分离及纯化。本文对大孔树脂分离黄杞叶总黄酮进行了研究。

1 实验材料

黄杞叶药材，产自广西；DA201、DM301型大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司）；HPD600、HPD700大孔吸附树脂（沧州宝恩化工有限公司）；DM130、860018、860021型大孔吸附树脂（山东鲁抗医药集团有限公司）；D101、AB-8大孔吸附树脂（安徽三星树脂科技有限公司）。

槲皮素对照品：批号10081-9905，供含量测定，中国药品生物制品检定所；镁粉：广州试剂厂，批号20030510。除高效液相色谱所用试剂为色谱纯，工艺考察所用95%乙醇为食用级酒精外，其余试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 动态吸附-洗脱性能考察：取黄杞叶125 g，加水煎煮至沸腾开始计时，每次加10倍量水，煎煮0.5 h，共煮3次。纱布滤过，合并滤液，减压浓缩至小体积，加水稀释，并定容至250 mL，摇匀，即得。分别称取各种型号新购的大孔吸附树脂10 g两份，一份60 ℃干燥至恒重，得干树脂质量，另一份加入95%乙醇50 mL浸泡12 h，湿法装柱（φ15 mm ×300 mm），用水反洗树脂柱，至洗液澄清为止。续用95%乙醇洗脱，洗至流出液在试管中用水稀释（1∶1）澄清为止。最后树脂柱用水洗至流出液无醇味，色谱柱备用。将25 mL样品液（相当于生药浓度0.5 g/mL）分别通过7种不同型号的已处理好的大孔吸附树脂柱，以5 mL/min的流速进行吸附，残留液重复吸附2次（用盐酸-镁粉检测，残留液保证吸附过量），接着用水洗至无色，最后用60%乙醇洗至盐酸-镁粉反应至阴性；依次接收残留液，水洗脱液和醇洗脱液，分别减压浓缩至小体积，加50%甲醇定容至25 mL。分别进行总黄酮的测定，计算上柱量（即饱和吸附量），比吸附量，比洗脱量。比上柱量＝（样品黄酮量-残留液黄酮量）/干树脂质量；比吸附量＝（样品黄酮量-残留液黄酮量-水洗脱液黄酮量）/干树脂质量；比洗脱量＝醇洗脱液黄酮量/干树脂质量。

2.2 洗脱液乙醇浓度的考察：取黄杞叶水提取液20 mL（相当于生药0.4 g/mL），通过预处理好的树脂（相当于干树脂10 g），用300 mL水洗脱后，依次用10%、20%、40%、60%、80%乙醇洗脱，各浓度分别收集100 mL及50 mL洗脱液，并将水洗液浓缩至100 mL，各溶液取样，测定后余下的溶液蒸干，干燥恒重。计算出膏率及总黄酮洗脱率、含量。洗脱率＝醇洗脱黄酮量/上柱黄酮量×100%；含量＝醇洗脱黄酮量/醇洗脱液干浸膏×100%。

2.3 药材量与树脂比的考察：根据D101型号树脂的比吸附量，按比吸附值的1、1/2、1/3、1/5的比例设计实验，则分别吸取水提取液10 mL（相当于生药0.4 g/mL），各自通过预处理好的D101树脂柱（φ15 mm ×300 mm），树脂为5、10、15、25 g；以吸附流速2 mL/min上样，静态吸附30 min后，取水适量洗脱至近无色，接着用60%乙醇洗脱，洗脱流速为5 mL/min，收集HCl-Mg反应呈阳性的流出液，各溶液减压浓缩，加50%甲醇定容至100 mL，测定总黄酮量，余下溶液蒸干，干燥至恒重，计算洗脱率和含量。

2.4 色谱柱径高比的考察：选择不同规格的玻璃层析柱（φ130 mm× 500 mm，φ222 mm×500 mm，φ320 mm×500 mm，φ417 mm× 500 mm），湿法装上预处理好的大孔吸附树脂（树脂30 g），则色谱柱的径高比在1∶3、1∶7、1∶10、1∶15，根据药材树脂的最佳比列为1∶2，取S-06水提取液30 mL（相当于生药0.4 g/mL）过柱。按上述方法吸附-洗脱，对洗脱液进行测定。

2.5 上样药液浓度的考察：在药材树脂比为1∶2，色谱柱径高比为1∶7条件下，分别取总黄酮含量为5.42、10.84、21.68、43.36 mg/mL的水提取液20、10、5、2.5 mL（相当于生药0.2、0.4、0.8、1.6 g/mL）进行吸附洗脱实验。按前述方法进行吸附洗脱，取各洗脱液进行测定。

2.6 树脂重复利用对黄杞叶总黄酮回收率的影响：按上述确定条件，取水提取液进行上柱、吸附、洗脱，在同一根树脂柱上重复操作7次。树脂每次使用完后采用常规方法进行处理，即：用2倍柱体积的95%乙醇和水反复冲洗2次，最后洗至无醇味，备用。

3 结果与讨论

3.1 不同型号大孔树脂的动态吸附-洗脱性能考察：不同型号的大孔吸附树脂，对各类成分的吸附性能会有明显的差别。考虑到效率和实际应用情况，对7种大孔吸附树脂进行动态吸附-洗脱性能考察，以比上柱量、比吸附量、比洗脱量为指标，综合考虑，选择对总黄酮具有特异富集纯化能力，且对黄酮能快速集中的进行洗脱，低成本的树脂型号。见表1、图1。

表1 7种不同型号大孔吸附树脂的吸附-洗脱性能比较

图1 树脂对黄杞叶中黄酮成分的吸附和洗脱量

DA201型号树脂比吸附量最大，为56.10 mg/g；DM301树脂比吸附量最小，只有10.34 mg/g；D101树脂比洗脱量最大，为49.38 mg/g；860018树脂比洗脱量最小，为23.01 mg/g。从比吸附量和比洗脱量来看，性能最好的前三种树脂型号为D101，860021，DM130，均属于弱极性类型的大孔吸附树脂，这三种型号树脂对黄杞叶总黄酮有良好的吸附、洗脱性能。

3.2 洗脱液乙醇浓度的考察：黄杞叶黄酮主要集中于40%～60%乙醇部分，黄酮收率共有83%，含量达22%；水洗脱及其他浓度乙醇洗脱液中没有测出总黄酮，而水洗能除去大部分的杂质，干浸膏占所有洗脱液干浸膏的48%。说明60%乙醇能快速集中的将S-06中黄酮洗脱下来。洗脱程序确定为：水洗脱至无色后，用60%乙醇洗脱，收集HCl-Mg反应呈阳性的流份。见图2。

图2 不同浓度乙醇洗脱液中总黄酮洗脱率及含量的考察

3.3 药材量与树脂比的考察：60%乙醇对D101型大孔吸附树脂洗脱S-06总黄酮的效果在药材树脂比例为1∶2时最好。树脂使用量在饱和吸附所需量2倍以上时，洗脱率出现下降趋势，分析原因可能是树脂柱偏高，而有效成分在动态吸附-解吸附平衡过程中所需时间加长，虽然分离效果会越好，但树脂柱偏高会造成有效成分损失、耗时、高成本等问题，因此选择药材树脂比为1∶2。见图3。

图3 不同药材树脂比的动态洗脱曲线

3.4 色谱柱径高比的考察：大孔吸附树脂色谱柱径高比在一定程度上影响分离效果，适当的径高比既能保证树脂柱良好的分离效果和节省时间[1]。选择色谱柱径高比为1∶3、1∶7、1∶10、1∶15四个比列进行考察。在色谱柱径高比为1∶3时，洗脱率只有70%，总黄酮含量为16%；在比例为1∶7时，洗脱率接近90%，随色谱柱径高比的扩大，洗脱率增加，在比例为1∶15时洗脱率达93%，此时总黄酮含量为18.7%。见图4。

图4 不同色谱柱径高比的动态洗脱曲线

色谱柱径高比例越大，洗脱效果越好，在径高比1∶7以上，洗脱率增长速度趋于平缓，总黄酮含量变化与洗脱率相似，增长速率在径高比1∶7后亦趋于平缓。故本选择色谱柱径高比为1∶7。

3.5 上样药液浓度的考察：具有相同总黄酮含量的不同浓度的水提取液，具有不同的体积、黏性、pH值等，故对不同浓度的上柱药液进行考察。黄酮浓度为10.84 mg/mL左右时（相当于生药浓度0.4 g/mL）时洗脱率出现拐点，总黄酮洗脱效果最好，上样浓度过低或过高都会影响洗脱效果，故最佳上样浓度可以确定为相当于生药浓度0.4 g/mL。见图5。

图5 上样药液不同浓度的动态洗脱曲线

3.6 树脂重复利用时对黄杞叶总黄酮回收率的影响：黄杞叶总黄酮的回收率在前5次树脂重复使用中有升高趋势，本实验进行了7次考察，树脂无明显的变化，表明该大孔吸附树脂在既定的工艺条件下得到充分的利用，且吸附洗脱性能比较稳定[2]。见图6。

图6 大孔吸附树脂重复利用时对总黄酮回收率的影响

4 结 论

通过大孔吸附树脂对黄杞叶黄酮成分的动态吸附-洗脱性能考察，筛选出吸附洗脱黄酮的最佳树脂型号D101，对黄杞叶总黄酮的动态饱和吸附量为55 mg/g。确定的工艺参数与条件如下：药材树脂比为1∶ 2，树脂柱径高比为1∶7，上样药液为水提液[3]，浓度相当于生药浓度0.4 g/mL，以水、10%乙醇、60%乙醇进行洗脱，洗脱量分别为10、10、5倍树脂柱量，收集60%乙醇洗部分，减压浓缩至干，即得黄杞叶总黄酮提取物，总黄酮回收率在90%以上，同时树脂可以重复使用7次以上。

[1] 钟正贤,周桂芬,陈学芬,等.黄杞总黄酮活血化瘀作用研究[J].广西中医药,1999,22(4):45-48.

[2] 潘照斌,李棐朝,廖月娥,等.黄杞叶总黄酮对大鼠实验性脑缺血保护作用的研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(5):223-226.

[3] 钟正贤,周桂芬,陈学芬,等.黄杞总黄酮的实验研究[J].时珍国医国药,2000,11(6):495-496.

The Research of Engelhardtia Leaves Flavonoids Macroporous Resin Separation

WANG Fen, ZHANG Xue-ling, LI Jian-xu*
(Department of Pharmacy, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, China)

ObjectiveTo get an efficient preparative separation process of flavonoid crude extracts of leaves of Engelhardtia roxburghiana wall.MethodThe optimum resin was to chosen through the researches of their character of adsorption and desorption of FEE.ResultsD101 resin offers the best adsorption capacity, and adsorption and desorption ratios. The dynamic adsorption capacity D101 resin was 55 mg/g. The adsorption and desorption experiments have been carried out on a D101 resin packed column to get the optimal separation process of FEE. The crude material and resin ratio is 1∶2, the hight and diameter ratio is 1∶7, the solution concentration equal to crude material is 0.4 g/mL. The aquatic extract was applied to column, washed by sixcolumn volumes of water, 10 sixcolumn volumes of 10% alcohol, 5 sixcolumn volumes of 60% alcohol successively. The part of 60% alcohol was collected and concentrated by vacuum drying method to get FEE.ConclusionsD101 resin offers the best adsorption capacity, and adsorption and desorption ratios of FEE. This D101 resin method provides a potential approach for large-scale separation and purification of FEE with recovery of 90% higher.

Flavonoid; Leaves of Engelhardtia roxburghiana wall; Resin

R282.710.3

B

1671-8194（2014）34-0022-03

*通讯作者：E-mail： yanshu023@163.com