贺德刚* 杨晓萍

（1 厦门大学附属第一医院杏林分院内科，福建 厦门 361000；2 石河子大学医学院第一附属医院肾病科，新疆 石河子 832008）

整合素连接激酶在大鼠阿霉素肾病模型中的表达

贺德刚1* 杨晓萍2

（1 厦门大学附属第一医院杏林分院内科，福建 厦门 361000；2 石河子大学医学院第一附属医院肾病科，新疆 石河子 832008）

目的动态观察大鼠阿霉素肾病模型中整合素连接激酶（ILK）的表达变化，探讨其与肾小球疾病的关系。方法用尾静脉注射阿霉素建模，用光镜、电镜观察肾脏病理改变，免疫荧光观察ILK在不同时间点模型组肾组织的表达改变。结果①与对照组比，前4周，模型组24 h尿蛋白量7 d增加，21 d达高峰（P＜0.01）；后8周，模型组24 h尿蛋白量逐渐减少，84 d降到最低值（P＜0.01）；②与对照组比，前4周，模型组肾小球ILK的表达7 d减少，14 d明显增加（P＜0.05）；后8周，模型组ILK表达逐渐减少（P＜0.05）；③电镜显示：前4周模型组大鼠足细胞足突广泛融合；后8周，模型组足细胞病变进一步加重，出现了其与基底膜的分离、脱落；④足细胞ILK表达的变化与模型组24 h尿蛋白定量的变化呈正相关（r=0.897，P＜0.01）。结论①ILK早期出现表达增加及分布异常，可能是导致蛋白尿的原因及判断肾小球足细胞损伤的一个早期重要指标。②ILK与蛋白尿呈正相关，其在肾组织中表达的高低对肾脏疾预后的判断具有一定意义。

阿霉素；蛋白尿；ILK

目前，足细胞损伤的研究已成为探索肾小球疾病发病机制的研究热点。足细胞是肾脏的固有细胞之一，是肾小球滤过屏障重要组成部分，它在蛋白尿的产生中作用尤为重要。而整合素连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞增殖、分化、凋亡等中都起重要作用。近年来研究表明ILK在肾小球足细胞中表达水平较高，在维持肾小球基底膜的完整性、介导足细胞与肾小球基底膜黏附、基底膜结构和足细胞功能方面发挥重要作用[1-2]。此实验用一次性尾静脉注射盐酸阿霉素的方法建立大鼠阿霉素肾病模型，测定不同时间点大鼠尿蛋白的量，应用免疫荧光技术和电镜观察ILK在不同时间点大鼠肾组织中的表达情况，探讨在阿霉素肾病模型中ILK的表达变化与蛋白尿发生的关系。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂：雄性清洁级SD大鼠84只，体质量180～220 g（新疆流行病研究所）。阿霉素（深圳万乐药业有限公司）；兔抗ILK抗体（Santa Cruz公司）；罗丹明标记羊抗兔抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.2 动物模型的制备：将SD大鼠随机分为两组：对照组、模型组各42只，采用尾静脉注射阿霉素（浓度2 mg/mL，7.5 mg/kg剂量），建立阿霉素肾病模型，对照组大鼠尾静脉注射等体积生理盐水[3]。

1.3 大鼠标本收集、检测：两组大鼠于建模后第7、14、21、28、42、56、84 d处死，每组各6只。宰杀前1 d用代谢笼留取24 h尿液，宰杀前通过内眦静脉采血，留取大鼠肾脏组织进行病理检测。

1.4 肾脏病理观察：①标本大体观察；②光镜观察：肾脏经福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE、Masson、PAS染色观察。③电镜观察：留取肾皮质组织块约1 mm3，经戊二醛固定、锇酸后固定、脱水、环氧树脂618包埋，超薄切片后醋酸铀-柠檬酸铅染色，电镜观察。

1.5 肾小球ILK免疫荧光染色及定量分析：大鼠的肾组织经液氮冰冻包埋，在-20 ℃恒冷冰冻切片机以3 µm厚度连续切片，-20 ℃冻存，37 ℃干燥，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS冲洗，10%正常山羊血清封闭1 h，用一抗（抗ILK抗体）在4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，再用二抗（罗丹明标记的抗-兔IgG）在37 ℃孵育1 h，PBS冲洗，DAPI封片。用PBS代替一抗作空白对照。用激光共聚焦扫描显微镜（德国ZEISS公司ISM510型）进行单盲读片，每个标本均采集3个肾小球进行分析。各观察标本的表达量用Zeiss LSM多功能真彩色图像分析系统测定肾小球中ILK的平均吸光度值。若信号分布不均匀或节段消失，则视为表达部分缺失，ILK蛋白部分脱落；若阳性信号分布均匀、连续，视为表达完整，ILK蛋白存在。

表1 两组大鼠各时间点24 h尿蛋白量（mg/24 h）

表1 两组大鼠各时间点24 h尿蛋白量（mg/24 h）

表2 两组大鼠各时间点ILK免疫荧光半定量分析

表2 两组大鼠各时间点ILK免疫荧光半定量分析

1.6 统计学方法：各项指标以均数±标准差表示。实验数据运用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。多组比较时，若方差齐则采用单因素方差分析；若方差不齐则采用秩和检验。用Spearman相关分析方法作指标相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肾小球的病理形态观察：光镜、电镜观察对照组肾小球的结构正常，足细胞的足突形态正常，无融合或消失，足细胞无脱落。模型组肾小球于第14天可见足细胞足突的形态变化，部分肿胀、融合，系膜细胞稍增多。于第42天，足细胞足突融合或消失明显，部分基底膜裸露，系膜细胞增生，部分肾小球毛细血管襻出现阶段性硬化伴肾小管萎缩，系膜基质增生；第84天，足细胞脱落、消失，肾小球局灶节段性硬化明显，肾小管萎缩，系膜细胞和系膜基质明显增生，出现FSGS典型病理改变。

2.2 尿蛋白的变化：两组大鼠24小时尿蛋白数据统计分析见表1，结果显示：模型组24 h尿蛋白定量均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。前4周为微小病变阶段，模型组24小时尿蛋白从第7天开始增加，于第21天达到高峰，均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。后8周为局灶阶段性硬化阶段，模型组24 h尿蛋白定量从第42天开始减少，于第84天减到最低，均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 肾脏ILK表达定位分布、荧光形态计量：荧光显微镜下观察到ILK蛋白在肾小球的定位分布规律，对照组ILK沿肾小球基底膜上皮细胞侧连续均匀分布，呈线型荧光。模型组可见ILK表达呈点状或短线状，基底膜荧光有节段性缺失。

大鼠肾小球ILK表达荧光的形态计量数据统计分析见表2，结果显示：前4周，模型组肾小球中的ILK表达量在第7天有所减少，但随着时间的发展，模型组肾小球中的ILK表达量在第14天出现增加，第21天达到最大值，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。后8周为局灶阶段性硬化阶段，模型组ILK的荧光表达量从第42天开始减少，于第84天减到最低，均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 相关分析：模型组大鼠不同时间点肾小球中ILK的表达量与24 h尿蛋白量之间呈正相关（r=0.897，F=165.528，P＜0.01）。

3 讨 论

许多肾脏疾病的主要临床特征表现为蛋白尿，近年来关于蛋白尿的研究多以足细胞或裂孔隔膜相关蛋白为重点，通过对多种足细胞特异性蛋白分子（nephrin、podocin、P-选择素等）的研究，在蛋白尿的产生方面取得重大进展[4-5]。而在足细胞中表达水平较高ILK，是1996年发现的一种新的黏附蛋白，属丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，在进化上高度保守。已有研究显示它与肾脏上皮细胞间质转化、系膜细胞增殖和系膜基质沉积等过程关系密切。新近研究表明ILK主要以外周方式存在于肾小球，在足细胞呈强染色，对保持肾小球的滤过功能、维持肾小球基底膜的完整性和防止蛋白质的漏出有重要意义[6-8]。

本文用一次性尾静脉注射阿霉素的方法复制肾病模型，表现为病变的两个阶段。在前四周，表现为大量蛋白尿、低蛋白血症，与原发性微小病变肾病相似。实验中通过免疫荧光观察到对照组肾脏组织中ILK在肾小球的足细胞明显表达，这与文献的报道一致[6]。在肾病模型前四周，建立的早期（7 d），模型组大鼠出现蛋白尿、低蛋白血症，而此时模型组大鼠肾小球ILK的荧光表达量首先下降，可能为阿霉素及其代谢产物造成足细胞损伤所致，但随着造模时间的延长，模型组肾小球中出现ILK表达量的增加，并于第21天时达最高值，而同时检测到模型组大鼠尿蛋白的量进一步增加，血浆白蛋白进一步下降。分析其原因，此实验阿霉素肾病的主要病变部位是肾小球的足细胞，而足细胞具有高度分化、增生能力有限的特点[9-10]。在儿童先天性肾病综合征芬兰型（CNF），Kretzler等[11]观察到CNF的肾小球足细胞ILKmRNA水平增高，在小鼠肾毒性肾炎模型中，足细胞ILK表达增高亦引起足细胞表型改变，与基底膜黏附减少，从基底膜脱落，导致严重蛋白尿。Teixeira等[12]发现当肾小球足细胞中ILK活性增加时，可调节整合素的活性和亲和力，也引起足突细胞表型改变、足突消失，干扰其与基质的相互作用，使其与肾小球GBM分离、增殖，同时伴有细胞骨架的紊乱，抑制裂孔膜表面的P钙黏蛋白和CD2AP分子的表达，从而导致肾小球滤过膜的损伤和严重蛋白尿。在此阿霉素肾病模型中，足细胞ILK的表达发生了变化，出现了分布异常，免疫荧光结果显示ILK的分布从沿着肾小球基底膜线样分布逐渐转变为不连续性颗粒样或节段性斑片状分布，电镜显示模型组大鼠出现足细胞足突的肿胀、融合、消失，随着实验的进展ILK表达量在21 d出现最高值，而此时蛋白尿也明显增多，相关性分析显示模型组肾小球不同时间ILK表达量与24 h尿蛋白量成正相关（r=0.897，F=165.528，P＜0.01）。由此推断ILK介导足细胞与肾小球基底膜的黏附和蛋白尿的发生。而且通过此实验观察到ILK的表达变化早于足细胞损伤和蛋白尿的产生，依次分析ILK可能是判定足细胞损伤和蛋白尿的一个早期指标。

在阿霉素肾病模型后6周，表现为肾小球的局灶性、阶段性硬化，肾小管的萎缩，复制了局灶阶段性肾小球硬化模型。但随着造模时间的推移，大鼠肾小球中出现ILK表达量减少，模型组大鼠尿蛋白的量也进一步减少，并于第84天时达最低值。已有研究表明，在一些伴有大量蛋白尿的肾小球疾病中，可以观察到足细胞数量的减少。足细胞数量减少的原因有：凋亡、脱落、增殖有限、表型转变[13]。在此模型的后6周，我们观察到部分肾小球基底膜的增厚，部分基底膜裸露，足细胞数量减少，脱落或消失。Asanuma等[14]研究认为TGF-β1、bFGF 、PDGF等生长因子可以导致局部蛋白酶及其抑制剂的分泌不平衡，蛋白水解活性增加诱导GBM退化，造成足细胞和基底膜连接的损害，启动足细胞从GBM脱落。Teixeira等[12]研究表明ILK还能促进基质金属蛋白酶-2，9的分泌，该酶又可导致基底膜的降解，使基底膜完整性受到破坏而产生蛋白尿。在糖尿病肾病患者的肾组织中，Guo等[15]发现ILK在系膜细胞表达显著增加，与系膜细胞弥漫扩张相关，而在球性硬化和结节性硬化显著部位，ILK表达减少。在此模型的后6周，损伤进一步加重，出现肾小球的局灶、阶段硬化，荧光定量显示ILK表达的进一步减少，呈节段性斑片状分布，电镜显示模型组大鼠足细胞的足突病变进一步加重，足细胞失去代偿能力，同时出现了足细胞与基底膜的分离、脱落，肾小球基底膜的降解，模型组大鼠的蛋白尿逐渐减少。依次推断ILK的表达变化与足细胞的损伤密不可分，与蛋白尿的产生息息相关，但足细胞凋亡此实验未观察到，什么时候启动肾小球硬化，是否只有ILK参与启动肾小球硬化尚未明确。通过次实验，证实了ILK与阿霉素肾病蛋白尿的产生之间具有一定的相关性，它可能直接或间接地影响了足细胞的功能状态，引起滤过屏障受损，导致蛋白尿，但其作用方式和具体途径还有待进一步研究。

[1] 刘小聪,刘必成,张燕林.整合素连接激酶与肾脏病[J].肾脏病与透析移植杂志,2008,17(4):363-367.

[2] 戴厚永,刘必成.整合素连接激酶与肾脏病变研究进展[J].东南大学学报(医学版),2009,28(5):443-446.

[3] 蔺建军,杨勇,高娜,等.阿霉素注射次数及剂量对肾病综合征模型的影响[J].中国中西医结合肾病杂志,2011,12(8):22-24.

[4] 李琴,龚伟.足细胞骨架结构的调节机制与蛋白尿[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2011,20(2):149-153.

[5] 杨维娜,任淑婷,成少利,等.Nephrin、TGF-β1和WT1在阿霉素肾病模型肾小球中的表达及意义[J].西安交通大学学报(医学版),2010,31(2):172-176.

[6] Li L,Bai YK.New progression of integrin-linked kinase and kidney disease[J].Int J Urol Nephrol,2008,28(4):520-523.

[7] 陈瑜,刘超.整合素连接激酶与糖尿病肾病[J].医学研究生学报,2009,22(1):100-103.

[8] 毛忠懿,吴雄健,陶立刚.ILK和TGF-β1在实验性大鼠肝纤维化中的表达和意义[J].安徽医药,2014,18(9):1630-1633.

[9] 彭亚琴,莫樱,蒋小云,等.阿霉素肾病大鼠肾组织中nephrin和CD2AP的表达及意义[J].中山大学学报(医学科学版),2009,30(1):15-20.

[10] 杨维娜,任淑婷,钱亦华,等.阿霉素肾病大鼠肾小球中足细胞数量及nephrin、VEGF的表达变化[J].四川大学学报(医学版),2010,26(3):458-463.

[11] Kretzler M.Regulation of adhesive in teraction between podocytes and glomerular basemet membrane[J].Microsc Res Tech,2002,57(4):247-253.

[12] Teixeira V ed P,Blattner SM,Li M,et al.Functional consequences of integrin-linked kinase activation in podocyte damage [J]. Kidney Int,2005,67:514-523.

[13] Shankland SJ.The podocyte's response to injury:role in proteinuria and glomerulosclerosis[J].Kidney Int,2006,69(12):2131-2147.

[14] Asanuma K,Shirato I,Ishidoh K,et al.Selectire modulation of the secretion and poteinases and their in hibitors by growth factors incultured differentiated podocytes[J].Kidney Int,2002,62(3):822-831.

[15] Guo L,Sanders PW,Woods A,et al.The distribution and regulation of integrin-linked kinase in normal and diabetic kidneys[J].Am J Pathol,2001,159:1735-1742.

Expression of Integrin-Linked Kinase in Rat Model of Adriamycin Nephrosis*

HE De-gang1*, YANG Xiao-ping2
(1 Department of Internal Medicine, the Frist Affilicated Hospital of Xinglin Hospital Branch of Medical College of Xiamen University, Xiamen 361000, China; 2 Department of Nephrology, the Frist Affilicated Hospital of Shihezi University School of Medicine, Shihezi 832008, China)

ObjectiveTo dynamically observe the expression of ILK in rat model of adriamycin nephrosis, and to explore the possible relation between it and renal glomerular disease.MethodsThe model of adriamycin nephrosis was established by injection with adriamycin via tail-vein for one time, the kidney tissues at different time rats were studied using electronic microscope and immunofluorescence.Results①Compared with the control group, during the first four weeks, 24 h urine protein excretion in the model group was gradually elevated during the frist 7 days and reached its peak on the 21st day (P<0.01). During the later eight weeks, 24 h urine protein of rats in the model group gradually decreased and reached a minimum value during on the 84th day. ②Compared with the control group, during the first four weeks, the expression of ILK was significantly down-regulated with the progression of proteinuria, and elevated and reached its peak during the frist 14 days (P<0.05). After eight weeks, the expression of ILK decreased gradually(P<0.05). ③During the first four weeks,the foot process fusion was seen on the seventh and fourteenth days with electronic microscope. After eight weeks, podocyte lesion of rats in model group further aggravating, appeared to be separated from podocyte and basement membrane. ④The expression of ILK was positively correlated wiIh the amount of 24 h urinary protein(r=0.897, P<0.01).Conclusions①ILK presents early over-expression and abnormal distribution, possibly suggesting a cause of proteinuria occurrence and an important early indicator for acute podocyte injury. ②ILK was positively associated with proteinuria and its renal tissue expression has a certain significance for the judgment on and kidney disease prognosis.

Adriamycin; Proteinuria; ILK

R692

B

1671-8194（2014）34-0005-03

石河子大学联合基金项目（编号：LHJJ2010B09）

*通讯作者：E-mail： hedegang@126.com